La gluconeogénesis hepática

Las señales gluconeogénicas regulan la homeostasis del hierro a través de la hepcidina en ratones

Chiara Vecchi, Giuliana Montosi, § Cinzia Garuti, § Elena Corradini, Manuela Sabelli, Susanna Canali y Antonello Pietrangelo *

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Abstracto

Antecedentes y Objetivos

La gluconeogénesis hepática proporciona combustible durante la inanición, y se induce anormalmente en personas obesas o con diabetes. Los trastornos metabólicos comunes asociados con la gluconeogénesis activa y la resistencia a la insulina (obesidad, síndrome metabólico, diabetes y enfermedad hepática grasa no alcohólica) se han asociado con alteraciones en la homeostasis del hierro que alteran la sensibilidad a la insulina y promueven la progresión de la enfermedad. Investigamos si las señales gluconeógenas controlan directamente la hepcidina, un importante regulador de la homeostasis del hierro, en ratones hambrientos (un modelo de gluconeogénesis persistentemente activada y resistencia a la insulina).

Métodos

Se investigó la regulación hepática de la expresión de hepcidina en ratones nulos C57BL / 6Crl, 129S2 / SvPas, BALB / c y Creb3l3 - / -. Los ratones fueron alimentados con una dieta de chow estándar equilibrada con hierro o una dieta deficiente en hierro durante 9 días antes de la muerte, o durante 7 días antes de un período de hambre de 24 a 48 horas; Los tejidos del hígado y del bazo luego se recogieron y analizaron mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa cuantitativa y análisis de inmunotransferencia. También se midieron los niveles séricos de hierro, hemoglobina, hepcidina y glucosa. Se analizaron las células de hepatoma humano (HepG2) y hepatocitos primarios de ratón para estudiar el control transcripcional de Hamp (el gen que codifica Hepcidin) en respuesta a estímulos gluconeogénicos utilizando ARN de interferencia pequeña, promotor de luciferasa y análisis de inmunoprecipitación de cromatina.

Resultados

La inanición condujo a una mayor transcripción del gen que codifica la fosfoenolpiruvato carboxianasa 1 (una proteína implicada en la gluconeogénesis) en hígados de ratones, niveles aumentados de hepcidina y degradación de ferroportina, en comparación con ratones no estrellados. Estos cambios produjeron hipoferremia y retención de hierro en el tejido hepático. Los hígados de ratones hambrientos también tenían niveles aumentados de ARNm de Ppargc1a y mRNA de Creb3l3, que codifican un co-activador transcripcional implicado en el metabolismo energético y un factor de transcripción específico del hígado, respectivamente. El glucagón y un análogo de adenosina monofosfato cíclico aumentaron la actividad del promotor y la transcripción de Hamp en células hepáticas cultivadas; Los niveles de Hamp se redujeron después de la administración de pequeños ARN interferentes contra Ppargc1a y Creb3l3. PPARGC1A y CREB3L3 unido el promotor Hamp para activar su transcripción en respuesta a un análogo de adenosina monofosfato cíclico. Creb3l3 - / - ratones no up-regulate Hamp o se convierten en hipoferrómico durante la inanición.

Conclusiones

Hemos identificado un vínculo entre la glucosa y la homeostasis de hierro, lo que demuestra que Hepcidin es un sensor gluconeogénico en ratones durante la inanición. Esta respuesta está implicada en la adaptación metabólica hepática al aumento de la demanda de energía; Conserva el hierro de tejido para las actividades vitales durante la retirada de alimento, pero puede causar la retención excesiva del hierro y la hipoferrémia en desórdenes con gluconeogenesis activado persistente y resistencia de insulina.

Palabras clave: Coactivador Receptor-Gama Activador Proliferador de Peroxisoma 1-Alfa (PGC1A), Proteína de Enlace del Elemento de Respuesta de AMPc-H (CREBH), Glucagon, Modelo de Ratón

Abreviaturas utilizadas en este trabajo: cAMP, adenosina monofosfato cíclico; ChIP, inmunoprecipitación de cromatina; CREBBL3 / CREBH, proteína de unión a un elemento de respuesta de adenosina monofosfato cíclico de tipo 3 3; ER, retículo endoplásmico; FPN1, ferroportina; HAMP, hepcidina; IL, interleuquina; NAFLD, enfermedad hepática grasa no alcohólica; Pck1, fosfoenolpiruvato carboxianasa 1; PPARGC1A, coactivador gamma del receptor activado por proliferador de peroxisoma 1-α; QRT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa; SiRNA, pequeño ARN interferente

La adaptación a diferentes estados, como el ejercicio, el descanso, y el hambre o la sobrenutrición, es esencial para la vida. A su vez, la disfunción y la perturbación de estas redes pueden conducir a desequilibrios metabólicos, que si no corregidos inducen enfermedades como la obesidad o la diabetes. La adaptación metabólica está controlada en gran medida por los co-reguladores transcripcionales y los factores de transcripción responsables, respectivamente, de detectar trastornos metabólicos y ajustar la respuesta transcripcional.1 Durante la inanición, esta respuesta adaptativa es esencial para la supervivencia de la especie y el hígado juega un papel central en Este proceso como un sitio principal para la gluconeogénesis y la producción de energía.2 En las primeras etapas, el hígado moviliza la glucosa de sus reservas de glucógeno; A medida que el ayuno avanza, oxida la grasa para proporcionar energía tanto para la gluconeogénesis como para el substrato para la cetogénesis. La generación de azúcar a partir de sustratos de carbono sin azúcar (gluconeogénesis) implica varias reacciones catalizadas por enzimas que tienen lugar tanto en el citosol como en las mitocondrias.

El hierro es esencial para las actividades redox vitales en la célula, en parte Icular es necesaria para la respiración y la producción de energía en las mitocondrias (que son también el sitio único para la síntesis del hemo y el sitio principal para la biosíntesis del racimo Fe-S), y también es importante para la biogénesis de las mitocondrias.3 Un número de anomalías de hierro, Baja anemia sérica de hierro / hierro restringida a la sobrecarga hepática / sistémica de hierro, se han descrito en trastornos humanos con vías de señalización gluconeogénicas activadas, incluyendo obesidad, síndrome metabólico, síndrome metabólico 5-7 y diabetes.8,9 Curiosamente, el exceso de hierro se ha asociado Con empeoramiento de la sensibilidad a la insulina y la progresión de la enfermedad, mientras que la eliminación de hierro se ha demostrado ser beneficiosa.6,8,10 Sobre la base de estas premisas, preguntamos si el estado de hierro podría ser regulado directamente por señales gluconeogénicas. De hepcidina, un péptido circulante similar a la defensina que degrada al ferro exportador de ferroportina (FPN1), lo que determina la extensión de la liberación o retención de hierro en la célula.11 La expresión de la hepcidina está controlada transcripcionalmente por una serie de factores que suministran las señales estimuladoras o inhibidoras pertinentes a la maquinaria nuclear y activan o desactivan el gen de la hepcidina (HAMP). Los principales factores de transcripción estimuladora incluyen la madre pequeña contra las proteínas decapentaplejicas (SMAD), que unen el elemento sensible a la proteína morfogenética ósea y entregan la "señal de hierro", 12,13 STAT-3, principalmente implicada en la señal inflamatoria 14-16 y cíclica El CREB3L3 (también conocido como CREBH), más recientemente encontrado para mediar la inducción de la hepcidina por el estrés del retículo endoplásmico (ER) 17, desencadenado por una variedad de estados fisiológicos y fisiopatológicos.18-20 Por lo tanto, Nos hemos centrado en la investigación de la regulación de la expresión de hepcidina en el hígado en respuesta a estímulos gluconeogénicos. Para este fin, se estudiaron ratones sometidos a inanición prolongada, un modelo clásico de gluconeogénesis persistentemente activada y resistencia a la insulina. El ensayo de inactividad fue el siguiente: C57BL / 6Crl, 129S2 / 8 a 10 semanas de edad, SvPas, ratones de tipo salvaje BALB / c y ratones nulos Creb3l3 - / - (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se les permitió acceso libre al agua y se les administró una dieta estándar de hierro equilibrada en pellets (2018S Teklad Global 18 % Protein Rodent Diet, Harlan Laboratories, (San Pietro Al Natisone, UD, Italia), contenido de hierro, 225 mg / kg) o hambre hasta 48 horas comenzando al comienzo del ciclo ligero. : Los ratones C57BL / 6Crl de tipo salvaje de 8 semanas de edad fueron alimentados con una dieta deficiente en hierro (ssniff EF R / M Iron Deficient, Charles River, Calco, LC, Italia, contenido de hierro <10 mg / kg) durante 9 Días antes de la muerte, o durante 6 días antes del período de hambre de 24 a 48 horas. Todos los animales recibieron cuidado humano según el cri Por la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia Animal de Laboratorio. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética para Estudios Animales en la Universidad de Módena y Reggio Emilia. Medidas de la Bóveda y Contenido de Tejido de HierroSerum hierro, ferritina sérica (kit Tina-quant Ferritin, Roche Diagnostics, Milán, Italia), hemoglobina y glucosa Determinado mediante un contador automatizado COBAS C501 (Roche, Milán, Italia) en el laboratorio clínico-químico del Hospital Universitario de Módena. Se determinó la hepcidina en suero usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (USCN Life Science, Hubei, China) según las instrucciones del fabricante, como se ha descrito anteriormente.9 Se analizaron cuerpos cetónicos en suero usando un kit de ensayo de $ β $ -hidroxibutirato (Sigma-Aldrich, Milán , Italia), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron las muestras de tejidos de bazo y de bazo como contenido de hierro no hemo según se informó previamente.21 Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real y reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa semicuantitativa El ARN celular total se obtuvo incubando células En reactivo de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa cuantitativa de iScript (qRT-PCR) Reagente de preparación de muestras (Bio-Rad, Milán, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN hepático total se extrajo como se describe.17 Se generó ADN complementario mediante transcripción inversa de 2 μl de tampón iScript (para células cultivadas) o 1 μg (para el hígado) con 200 μg de transcriptasa inversa ImProm-II (Promega, Milán, Italia) Instrucciones del fabricante. La expresión de mRNA se analizó utilizando SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad). Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1 complementaria. Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: 30 segundos a 98 ° C, seguido de 40 ciclos de 2 segundos a 98 ° C y 10 segundos a 60 ° C. Después de 40 ciclos de amplificación, los valores de umbral de ciclo se calcularon automáticamente usando los ajustes por defecto del software CFX Manager (versión 2.0; Bio-Rad) y los femtogramos de ADN complementario de partida se calcularon a partir de una curva estándar que cubre un rango de 5 órdenes de magnitud. Al final de El ciclo PCR, se obtuvieron curvas de fusión de los productos amplificados y se usaron para determinar la especificidad de la reacción de amplificación. En cada experimento, el cambio de la expresión de mRNA específico se informó como el aumento de veces en comparación con el de las células de control o ratones. La normalización de los datos de qRT-PCR se basó en RPL19 housekeeping mRNA expresión después de la validación utilizando el valor de estabilidad objetivo obtenido a partir del software CFX Manager (versión 2.0, Bio-Rad) .22 X-box unión proteína 1 (Xbp1) empalme se analizó como se describe Por Vecchi et al.17 Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1 complementaria. Los oligos de Hamp detectan el ARNm total de Hamp (ARNm de Hamp1 y Hamp2). Análisis de Western Blot Para el ensayo de FPN1, las muestras de hígado de ratón se homogeneizaron en tampón de lisis (150 mmol / , Tris 10 mmol / L, pH = 8, EDTA al 1 mmol / L, Triton X - 100 al 0,5%) que contiene cóctel inhibidor de proteasas 1: 100 (Sigma - Aldrich). Después de la centrifugación a 13.000 xg a 4 ° C durante 15 minutos, se recogió el sobrenadante y se ensayó la concentración de proteína mediante el método de Bradford. Se cargaron un total de 60 μg de extractos de hígado sin hervir los geles de acrilamida al 10% con tampón de muestra de Laemmli y se pasaron en tampón de electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida. Se analizaron las membranas con anticuerpos específicos: conejo anti-FPN1 (1: 1000; Alpha Diagnostic, Inc., San Antonio, TX), como se ha informado anteriormente 23, y anti-tubulina de ratón (1: 3000, Sigma-Aldrich), seguido de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano. El análisis de transferencia Western se realizó mediante sustrato Western Lightning Ultra (PerkinElmer, Waltham, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Células y aislamiento primario de hepatocitos Las células HepG2 de hepatoma humano se cultivaron en medio de Eagle modificado (MEM) (que contenía 1 g / l de glucosa), suplementado con 1 μmol / L de glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 μg / ml de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ◦ C.El hepatocito primario de 8 a 10 semanas, Se aislaron los ratones macho C57BL / 6Crl macho como se describió anteriormente.21 Se incubaron células HeepG2 y hepatocitos primarios de ratón durante 8 horas en presencia de 1 mmol / L de cAMP 8Br (Sigma-Aldrich) o durante 6 horas en presencia de 100 nmol / L de glucagón (Sigma-Aldrich), ambos en medio de cultivo de suero bovino fetal al 2%. Plasmas que codifican el CREB3L3-N marcado con etiqueta (la forma activa del factor), el ARNs de Interferencia Pequeña, la Transfección y el Ensayo de Luciferasa. CREB3L3 pequeño ARN interferente (siRNA) transfect Ion y luciferasa han sido reportados en otra parte.17 El Dr. Chang Liu (Nanjing, China) proporcionó amablemente el plásmido que codifica el coactivador gamma activado por proliferador de peroxisoma 1-α (PPARGC1A). El ARNip de PPARGC1A se obtuvo de Invitrogen (Life Technologies Italia, Monza, Italia) (PPARGC1AHSS116799). Inmunoprecipitación de cromatina La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se describió en otra parte17 con las siguientes modificaciones. En resumen, las células HepG2 se transfectaron utilizando el reactivo de transfección X-tremeGENE (Roche Applied Science, Milán, Italia) con plásmido que codifica CREB3L3-N marcado con Flag. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron tratadas con 1 mmol / L 8Br cAMP durante 8 horas y fijado para la reticulación de formaldehído y ChIP. Los complejos proteína-ADN se inmunoprecipitaron durante la noche usando los siguientes anticuerpos: anti-Flag (Sigma-Aldrich), anti-PPARGC1A (anti-PGC1A, Santa Cruz Biotecnología, Dallas, TX) o proteína fluorescente anti-verde (GFP) Cambridge, Reino Unido) como control negativo. Análisis estadísticos Todos los datos se controlaron para la distribución normal (pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk). Cuando se comparó una variable en 2 grupos, se utilizó una prueba t pareada o la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney, dependiendo de la presencia o ausencia de distribución normal de datos y / o tamaño pequeño de la muestra. Al hacer múltiples comparaciones estadísticas en un solo conjunto de datos, para los datos distribuidos normalmente se utilizó un análisis de varianza de 1 vía con las pruebas post hoc de Tukey o Dunnett, dependiendo de la presencia o ausencia de homoscedasticidad. Para los datos sesgados, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. En todos los análisis estadísticos, se consideró significativo un valor de P inferior a 0,05. Los datos presentados en las Figuras son media ± SEM. En los ratones hambrientos, el ARNm de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (Pck1), conocido por ser fácilmente sensible a los estímulos gluconeogénicos , Aumentó rápidamente a las 2 horas (Figura 1A), mientras que el ARNm de Hamp aumentó a las 5 horas, en concomitancia con una marcada disminución de la glucosa en suero, y permaneció aumentado durante 48 horas (Figura 1B). Además, la hepcidina sérica mostró un fuerte aumento a las 5 horas, aunque ligeramente disminuido en puntos posteriores (Figura 1C). Hamp inducción llevó a una disminución del suero iro N, y un incremento progresivo de ferritina sérica y contenido de hierro en el bazo y el hígado (Tabla 1). De acuerdo con el modelo de hepcidina de regulación del hierro, que implica una regulación post-translacional de la proteína ferroportina por la hepcidina, el ARNm hepático de Fpn1 permaneció sin cambios (Figura 1D) mientras que la proteína FPN1 se degradó de una manera dependiente del tiempo a partir de 5 horas ' (Figura 1E y F). No se detectó una regulación negativa de la ferroportina en el bazo (datos no mostrados). Como se discutió anteriormente, los principales estímulos para la transcripción de hepcidina in vivo son el aumento del suero y el hierro hepático 24, y las citoquinas producidas durante la inflamación y la infección, en particular la interleuquina 6 (IL6), 25 IL22,26 el factor de necrosis tumoral-α, 27 y el estrés ER. 17 En ratones sometidos a inanición prolongada, no pudimos detectar la regulación de citoquinas como la IL6 y el factor de necrosis tumoral α, mientras que la IL22 se deprimió por la retirada de alimentos (Figura 1A-C complementaria). IL1 β fue inducida por el ayuno a corto plazo, pero volvió a la normalidad a las 48 horas (Figura 1D], cuando la expresión de mRNA de hepcidina todavía se incrementó marcadamente. Se encontraron resultados negativos similares cuando se analizaron marcadores de inflamación marcador ARNm (Figura 1E) y marcadores de estrés ER (a saber, Xbp1 mRNA splicing, Figura 1F suplementario). Para tratar si la hipoferremia en ratones hambrientos fue causada por una menor ingesta de hierro asociada con la privación de alimentos, se estudiaron los ratones pre-mantenidos en una dieta privada de hierro durante 1 semana. Después de la dieta deficiente en hierro, este grupo de ratones mostraron niveles normales de hierro sérico (Figura 2A), pero casi redujeron a la mitad las reservas de hierro del bazo en comparación con los ratones alimentados mantenidos en una dieta balanceada con hierro (Figura 2B), sugiriendo una marcada redistribución de hierro a partir de la Almacenamiento hacia el torrente sanguíneo para mantener la producción de glóbulos rojos y mantener los niveles normales de hemoglobina (Figura 2C). Sin embargo, incluso bajo esta circunstancia, la inanición condujo a una disminución progresiva del hierro sérico (Figura 2A). Además, la expresión de ARNm de hepcidina, aunque deprimida en ratones de control (grupo deficitario de hierro) probablemente debido al estado latente de deficiencia de hierro y actividad de médula activa, todavía fue dramáticamente inducida por el hambre (Figura 2D). La activación de la hepcidina y la perturbación de la homeostasis del hierro durante la gluconeogénesis inducida por el hambre también se encontró en otras cepas de ratón probadas, tales como BALB / c (Figura 2A-C suplementaria) o 129S2 (Figura 2D-F suplementaria). En general, estos datos sugieren que, en los ratones hambrientos, los estímulos que son independientes de la inflamación y / o el estrés pueden ser responsables de la inducción de hepcidina.Figura 1Figura 1In vivo curso del tiempo de la hepcidina y ferroportin expresión en ratones durante el hambre. (A) Análisis en tiempo real de qRT-PCR de ARNm de Pck1 y (B) expresión de ARNm de Hamp en relación con el ARNm de Rpl19 doméstico en ratones C57BL / 6 alimentados con una dieta estándar (barra blanca) ... Figura 2 La Fase 2 induce la expresión génica de hepcidina también en Ratones pre-mantenidos en una dieta deficiente en hierro. Ratones C57BL / 6Crl machos de 8 a 10 semanas de edad fueron alimentados con una dieta balanceada con hierro o una dieta deficiente en hierro durante 9 días antes de la muerte (IB e ID, respectivamente), o para ... Tabla 1Tabla 1In Vivo Efectos de La expresión hepática de genes que codifican enzimas gluconeogénicas, tales como PCK1, está regulada por una red de factores de transcripción y cofactores, incluyendo CREB Proteínas28,29 y PPARGC1A.30 Recientemente se encontró que un miembro de la familia CREB, CREBH, está comprometido constitutivamente sobre el promotor de la hepcidina y lo transactiva de inmediato durante el estrés de ER.17 Tanto el ARNm de Ppargc1a como el de Creb3l3 son inducidos por gluconeogénesis hepática in vivo durante la inanición (Figura 3A y B). La hipótesis de que CREBH es un objetivo de PPARGC1A coactivación durante la inducción de la hepcidina por la gluconeogénesis activa. En consonancia con esta hipótesis, el silenciamiento de PPARGC1A en células HepG2 llevó a una disminución del 60% de la expresión de mRNA hepcidina, similar al efecto obtenido por CREB3L3 knockdown (Figura 3C) .Figura 3Figura 3Ppargc1a y Creb3l3 son inducidos por la inanición y están involucrados en la expresión de hepcidina . (A) Análisis de qRT-PCR en tiempo real de ARNm de Ppargc1a y expresión de ARNm de (B) Creb3l3 en hígado de ratones C57BL / 6 alimentados con una dieta estándar de hierro (barra blanca) y ... La gluconeogénesis inducida por privación de alimentos implica CAMP como principal mensajero intracelular en respuesta a los estímulos hormonales.31,32 HepG2 células expuestas a 8Br cAMP, un cAMP análogo, mostró un aumento significativo de ambos PCK1 y HAMP mRNA en un tiempo dependiente de la forma (Figura 4A]. Una tendencia similar de la activación de hepcidina también se encontró en hepatocitos primarios expuestos a glucagón o 8Br cAMP. Ambos tratamientos indujeron la expresión de ARNm de Pck1 y Hamp en hepatocitos cultivados, aunque la respuesta de Hamp fue significativa pero sensiblemente más baja que en células HepG2 (Figura 4B). Hepcidin estimulación por 8Br cAMP en células HepG2 transfectadas con si El ARN para PPARGC1A o CREB3L3 era apreciablemente más bajo en comparación con las células de control tratadas con cAMP 8Br (Figura 4C). Un efecto similar se documentó cuando se probó la respuesta de Hamp promotor de 8Br cAMP en presencia de PPARGC1A o CREB3L3 siRNAs (Figura 4D]. Para probar que PPARGC1A coopera con CREBH para activar la hepcidina en respuesta a la gluconeogénesis, se evaluó si el coactivador PPARGC1A / CREBH transduce y se une al promotor de hepcidina en respuesta a estímulos gluconeogénicos. La sobreexpresión de PPARGC1A en células HepG2 llevó a una transactivación significativa del promotor Hamp, lo que indica que el factor de transcripción está involucrado en la regulación del promotor hepcidina (Figura 4E). En un estudio anterior se demostró que CREBH ocupa constitutivamente el promotor HAMP y lo transactiva en respuesta al estrés ER.17 En este caso, el ensayo ChIP mostró que, además de la ocupación del promotor de hepcidina constitutiva conocida por CREBH (Figura 4F, αFlag, células de control ), PPARGC1A también se une constitutivamente a la misma región (Figura 4F, αPGC1A, células de control). De acuerdo con los estudios informados anteriormente, después de la exposición de las células HepG2 a 8Br cAMP, se estabilizó más CREBH en el promotor HAMP en presencia de una unión estable de PPARGC1A (Figura 4F, células tratadas con cAMP 8Br) Figura 4 La Figura 4Hepcidina es inducida por gluconeogénico Señales a través de PPARGC1A / CREBH. (A) Las células HepG2 se cultivaron en presencia de un análogo de cAMP (8Br cAMP) y se analizaron en diferentes puntos de tiempo para la expresión de ARNm de PCK1 y HAMP mediante PCR en tiempo real. (B) Pck1 y ... En ratones Creb3l3 nulos, de acuerdo con los estudios in vitro, la inanición indujo correctamente el ARNm de Pck1 (Figura 5A), pero no pudo activar el ARNm de hepcidina (Figura 5B), modificar los niveles de hepcidina en suero (Figura 5C ), O causar hipoferremia (Figura 5D). De la nota, Ppargc1a mRNA todavía se indujo por hambre (Figura 5E], pero aparentemente no fue capaz de estimular la expresión de hepcidina en ausencia de CREBH. Estos datos apoyan un papel de CREBH en la activación de la hepcidina por estímulos gluconeogénicos en el hígado. Curiosamente, los niveles de glucosa en suero fueron significativamente más bajos en ratones nulos Creb3l3 hambrientos en comparación con ratones de tipo silvestre hambrientos (Tabla 2). Aparentemente, el aumento de los cuerpos cetónicos séricos durante la inanición fue más pronunciado en los ratones nulos Creb3l3 (4.7 a 5.6 veces) en comparación con los ratones control (3.1 a 3.5 veces) (Tabla 2). Hepcidina en ratones Creb3l3 - / -. Los ratones machos de tipo salvaje de 10 a 10 semanas de edad (WT) o Creb3l3 - / - fueron sacrificados durante 24 ó 48 horas antes de la muerte. (A) ARNm de Pck1 y (B) la expresión de ARNm de Hamp se evaluó mediante PCR en tiempo real qRT. ... Tabla 2Tabla 2En Vivo Efectos de la inanición sobre la glucosa y la cetona Estado del cuerpo en Creb3l3 Null MiceGo to: DiscussionHepcidin es constitutivamente producido por el hígado para mantener los niveles de hierro en el plasma dentro de un estrecho rango fisiológico. Para ello, detecta una variedad de estímulos fisiológicos y fisiopatológicos que tienden a alterar los niveles de hierro en la sangre y responde inhibiendo la ferroportina, el principal exportador de hierro de los mamíferos.33 En este estudio se demostró que la hepcidina está regulada transcripcionalmente también por señales gluconeogénicas a través de PPARGC1A / CREBH. La inducción de esta vía reguladora en un modelo clásico de resistencia a la insulina / gluconeogénesis activada, es decir, el hambre, conduce a la retención de hierro de tejido y la deficiencia de hierro circulatorio. La hipoferremia es claramente secundaria al aumento de la retención de hierro en tejidos después de la inducción de la hepcidina y no a la reducción de la ingesta de hierro porque todavía se conserva en ratones pre-mantenidos en una dieta privada de hierro (Figura 2). La activación de la hepcidina y la perturbación de la homeostasis del hierro durante la gluconeogénesis inducida por el hambre parecen representar una respuesta defensiva general en los roedores debido a que se encontró en otras cepas de ratón probadas. Sin embargo, las diferencias en términos de la duración de la inducción de la hepcidina y la extensión de las modificaciones del estado de hierro se detectaron claramente entre las diversas cepas de ratones hambrientos. Esto podría explicarse por el hecho de que tanto la respuesta gluconeogénica / la expresión del gen gluconeogénico como la expresión del gen del hierro / hierro pueden variar apreciablemente entre las cepas de ratón, como también documentado por la expresión significativamente mayor del gen Pck1 en ratones C57BL / 6 Ratón modelo para estudiar la gluconeogénesis / resistencia a la insulina34,35 y el modelo que más estrechamente paralelos a la respuesta gluconeogénica a la inanición visto en seres humanos) en comparación con 129S2, BALB / c, y Creb3l3 null ratones (que realmente muestran un fondo genético mixto de 129S1 , 129X1, C57BL / 6, FVB / N). Una mirada cercana a la inducción del curso del tiempo de los ARN de Pck1 / Hamp (Figura 1A y B) y Ppargc1a / Creb3l3 (Figura 3A y B) sugiere que la ráfaga inicial de 5 horas de la transcripción de Hamp depende en gran medida del aumento de la expresión de Creb3l3. Posteriormente, el aumento de la expresión de Ppargc1A probablemente sustente la transcripción de la hepcidina mejorando y estabilizando adicionalmente la unión a CREBH en el promotor Hamp (Figura 4F, estudio ChIP). Pudimos reproducir Uce el efecto de la inanición in vitro, en una línea celular de hepatoma y hepatocitos primarios cultivados, utilizando diferentes estímulos gluconeogénicos (Figura 4). Sin embargo, la respuesta del gen Hamp a las señales gluconeogénicas en hepatocitos primarios fue menor que en las células de hepatoma. Esto puede depender del hecho de que en los hepatocitos primarios las señales gluconeogénicas pueden atenuarse, como se indica por la menor inducción de Pck1 en hepatocitos primarios expuestos a cAMP 8Br en comparación con células HepG2 (Figura 4B vs A), y / o que factores adicionales esenciales Para la hepcidina maquinaria transcripcional se pierden en los hepatocitos primarios después de la interrupción de la arquitectura del hígado / microambiente.La nueva vía reguladora identifica la glucosa y el metabolismo del hierro en el hígado e identifica la hepcidina, la hormona del hierro, como un sensor gluconeogénico.PPARGC1A es un coactivator transcripcional Que regula los genes implicados en el metabolismo energético. Durante la inanición, el PPARGC1A se activa fácilmente para activar la maquinaria gluconeogénica, pero también para estimular la biogénesis mitocondrial y la respiración 36, que son esenciales para soportar las mayores demandas de energía. Curiosamente, en los osteoclastos, la biogénesis mitocondrial involucra proteínas CREB / PPARGC1A, pero requiere absorción de hierro y suministro a proteínas respiratorias mitocondriales.37 Aquí encontramos que PPARGC1A ocupa constitutivamente el promotor de hepcidina y, en respuesta a estímulos gluconeogénicos, estabiliza la unión de CREBH y transactiva HAMP promotor. CREBH es un factor de transcripción específico del hígado asociado al estrés asociado con el estrés, originalmente implicado en la inducción de genes de respuesta en fase aguda (como la proteína amiloide sérica y la proteína C reactiva38), y posteriormente se ha encontrado que activa la transcripción de HAMP.17 Based En publicaciones recientes y en este informe, CREBH ahora emerge como un regulador metabólico clave en el hígado: es activado por ácidos grasos y PPAR α, 39, 40 y regula la expresión de genes implicados en la lipogénesis hepática, oxidación de ácidos grasos y lipólisis bajo metabolismo Resulta interesante que también se ha encontrado que CREBH regula transcripcionalmente los genes críticos de la respuesta gluconeogénica hepática de Pck1 y glucosa.61 Aquí, informamos que CREBH se compromete constitutivamente con el promotor de la hepcidina para detectar el estrés gluconeogénico metabólico y modificar , En consecuencia, el tráfico de hierro. Es importante destacar que los ratones nulos Creb3l3 muertos de hambre muestran una reducción en la glucosa y una mayor producción de cuerpo cetónico. La adaptación al hambre es esencial para la supervivencia de especies.42 Aparentemente, la defensa contra patógenos representa una prioridad en la evolución de las especies. El hígado, como principal fuente de hepcidina, parece desempeñar un papel central en ambos procesos. Durante la infección, la hepcidina limita el hierro vital que se necesita para invadir microorganismos, contribuyendo así a la defensa del huésped.25 Durante la prolongada inanición, la hepcidina probablemente preserva el hierro del tejido y ayuda a mantener el equilibrio energético ya apoyar la gluconeogénesis en el hígado. Paradójicamente, en los trastornos humanos asociados con el exceso de alimentos y el almacenamiento, como la diabetes tipo 2, la obesidad y el síndrome metabólico, la gluconeogénesis persistentemente activada puede dar como resultado una sobreestimulación de la hepcidina, Acumulación de hierro y daño potencial. Los casos de exceso de hierro hepático inexplicado, caracterizado por altos niveles de ferritina sérica con saturación de transferrina normal o subnormal y asociados con anomalías metabólicas, fueron originalmente reportados por Moirand et al 43, quienes también introdujeron el término resistencia a la insulina asociada a sobrecarga de hierro (recientemente renombrado dismetabólico Síndrome de sobrecarga de hierro). Desde entonces se ha registrado deposición de hierro hepatocelular y / o mesenquimal, generalmente leve o leve, en la enfermedad hepática grasa no alcohólica (NAFLD) y la esteatohepatitis no alcohólica.44 La relevancia clínica del exceso de hierro en estos trastornos, en términos de desarrollo de la fibrosis y riesgo de cáncer, Es interesante debatir 45, pero los datos crecientes indican que el hierro puede sostener la actividad de la enfermedad y / o contribuir a su progresión.46-49 Curiosamente, los pacientes de NAFLD con sobrecarga de hierro mixta o mesenquimal (un patrón de deposición de hierro consistente con un modelo de "exceso de hepcidina ") Parecen más propensos a desarrollar fibrosis que aquellos con depósitos puros de hierro parenquimatoso (un patrón de deposición de hierro consistente con un" modelo de deficiencia de hepcidina ") 47,49. El mecanismo de deposición de hierro en el síndrome de sobrecarga de hierro : Sexo, dieta, actividad de la enfermedad, antecedentes genéticos (mutaciones genéticas de hemochromatosis HFE), origen étnico e inflamación (micro) pueden explicar la variab Del exceso de hierro y su patrón de distribución. Se plantea la hipótesis de que una fracción de pacientes distembólicos / NAFLD con saturación de transferrina normal-baja y depósitos de hierro hepático mixto / mesenquimal puede representar un subgrupo de pacientes con resistencia prominente a la insulina e inducción de hepcidina a través del glucógeno PPARGC1A / CREBH  Descrita aquí. En estos pacientes, la hepcidina, dependiendo del grado y duración de su inducción, puede modificar el tráfico de hierro local o sistemáticamente y conducir, respectivamente, a retención hepática simple de hierro con reflexiones sistémicas marginales (es decir, acumulación de hierro hepático mesenquimal o mixto con normal o subnormal Saturación de transferrina), o retención sustancial de hierro tisular, hipoferremia y anemia con restricción de hierro. Se necesitan más estudios para demostrar que la inducción inducida por la señal gluconeogénica de la hepcidina en ratones hambrientos también tiene lugar en otros casos de gluconeogénesis activada y resistencia a la insulina, tales como diabetes, obesidad o NAFLD. Si es así, debido al cada vez más reconocido efecto negativo del exceso de hierro en la progresión de estos trastornos, la nueva vía reguladora aquí descrita puede ofrecer nuevos objetivos terapéuticos potenciales para prevenir o corregir las alteraciones del hierro en trastornos metabólicos comunes. Los autores no revelan conflictos.Fundación Este trabajo fue apoyado por la concesión de Telethon GGP10233 y la concesión PRIN 2010REYFZH_005 a AP.Author nombres en negrita designar co-primera autoría compartida.Go a: Material SuplementarioSuplemento Figura 1Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc Nombre del objeto es fx1.jpgExpresión hepática de la inflamación o marcadores de estrés ER en ratones durante la inanición. Total de análisis de ARNm del hígado en el hígado de ratones C57BL / 6 alimentados con una dieta estándar (barra blanca) y hambre para los puntos de tiempo indicado (barras de color gris). (A-D) Análisis en tiempo real de qRT-PCR de la expresión de mRNA de citoquina en relación con el ARNm de Rpl19 de mantenimiento: (A) Il6, (B) Il22, (C) Tnf y (D) Il1β. (E) Crp mRNA expresión, como marcador inflamatorio, y (F) análisis de PCR Xbp1 mRNA splicing análisis, como marcador de estrés ER. Los resultados son media ± SEM de 6-8 ratones por grupo. Para el análisis de expresión de mRNA, los valores de control medios para el grupo de ratones alimentados se establecen en 1. En el análisis de empalme Xbp1, se muestran 3 ratones representativos por grupo. PM, peso molecular, control positivo de PC. Los valores de P se informan para comparaciones entre ratones alimentados y ratones en ayunas en cada punto de tiempo. * P <.05.Supplementary Figura 2 Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. Nombre de objeto es fx2.jpgFasting induce la expresión génica de hepcidina e hipoferremia in vivo en BALB / c y 129S2 / SvPas (129S2) ratones de tipo salvaje. Los ratones de tipo salvaje BALB / c (D-F) 129S2 / SvPas de ocho a 10 semanas de edad (A-C) se pusieron en ayunas durante 24-48 horas. Análisis en tiempo real de qRT-PCR de ARNm (A y D) Pck1, ARNm de Hamp (B y E) y hierro sérico (C y F) en ratones alimentados y en ayunas. Los resultados se expresan como la media \ pm SEM de 6-8 ratones por grupo. Para el análisis de expresión de ARNm en los paneles A y B y en D y E, los valores medios de control se ponen a 1 y se normalizan con respecto al ARNm de Rpl19 de mantenimiento. Los valores de P se informan para comparaciones entre ratones control alimentados y ratones en ayunas. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.Suplemento Tabla 1Suplemento Tabla 1

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