Laboratorio N°4 de Genética “Purificación de DNA bacteriano”

[pic 1]

Universidad Santo Tomás

Facultad de Ciencias

Carrera de Biotecnología

Laboratorio N°4 de Genética

“Purificación de DNA bacteriano”

Autores:

Fecha de entrega:

Profesor:

Introducción (1,0)

La extracción del ADN consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El mismo, está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. A su vez, Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Velázquez y col. (2022)

Entonces, a lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN.

OBJETIVOS

• Extracción de ADN con método Fenol: Cloroformo
• Extracción de ADN total de bacterias

Materiales y método (1,0)

BACTERIAS

• Bacillus subtilis (Gram positiva)
• Bacillus pumilus (Gram positiva)
• Bacillus amyloliquefaciens (Gram positiva)
• Bacillus velezensis (Gram positiva)
• Escherichia coli (Gram negativa)
• Pseudomonas spp (Gram negativa)

• -0 uL de lisosima (25 mg/mL)
• -400 μl de buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 25 mM, pH 8)
• -400 μl de fenol: cloroformo:isoamílico (25:24:1)
• -1000 μl de etanol 96%
• -20 μl de H2O destilada

Instrumentos:

• Centrifuga
• Tubos
• Nevera

Metodos

1) Colectar las células de un cultivo líquido (1,5 ml) por centrifugación a 5000 rpm durante 3 minutos y descartar el sobrenadante.

2) Repetir el paso 1 en el mismo tubo, pero resuspender el pellet obtenido en el paso 1 con el vortex antes de centrifugar.

3) Suspender las bacterias en 400 μl de buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 25 mM, pH 8).

4) Para las bacterias gram positiva, agregar 10 uL de lisosima (25 mg/mL) e incubar a a 37°C por 5, o hasta que la suspensión se clarifique

5) Adicionarle 400 μl de fenol:cloroformo:isoamílico (25:24:1). Mezclar con vortex durante 5 segundos

6) Centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm.

7) Colectar la fase acuosa (aproximadamente 400 μl de la fase superior) a un nuevo tubo eppendorff y agregarle 1 volumen de cloroformo. Mezclar con vortex 5 segundos.

8) Centrifugar 5 minutos a 14.000 rpm.

9) Transferir la fase acuosa (superior) a otro tubo y adicionar 1000 μl de etanol 96%

10) Incubar 30 minutos a -20°C para precipitar el ADN

11) Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm y 4°C

12) Centrifugar 5 min a 14.000 rpm y descartar el sobrenadante

13) Secar el pellet de ADN a 50°C y resuspender en 20 μl de H2O destilada.

14) Almacenar a -20 ºC.

Resultados (1,7)

        Aquí se exponen todos los resultados obtenidos y los cálculos realizados, siempre describiendo como se llego a ellos. Se deben incluir las tablas, gráficos o figuras que se consideres pertinentes para mantener el orden del informe.

        Es importante tener en cuenta que en esta sección solo se deben informar los resultados obtenidos, ya sean positivos o negativos. Aquí no se realiza el análisis de estos.

...