MEDIA FILIACION

Para realizar su objetivo la Genética Forense emplea dos técnicas principalmente: la RFLPs (Fragmentos de restricción de longitud polimórfica) y la PCR y la elección de la técnica a aplicar estará determinada por la cantidad y calidad del DNA presente siendo la segunda la más utilizada, ya que la RFLPs presenta grandes restricciones en estos aspectos.

Estas limitaciones son superadas por la PCR o amplificación en cadena de la polimerasa, ya que esta permite amplificar más de un millón de veces una muestra de ADN. Con el uso de la PCR muestras tan mínimas como pueden ser las halladas en un pelo con raíz, una minúscula mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética. Las regiones o fragmentos utilizados son los llamados marcadores genéticos, microsatélites o STRs.

Estos marcadores genéticos son regiones conocidas del DNA, muy variables de un individuo a otro y que se heredan sin cambios de una generación a la siguiente. A las distintas formas heredables de estos marcadores genéticos se les denomina alelos, por lo tanto constituyen una herramienta muy valiosa en los estudios de identificación genética y filiación ya que: cada individuo tendrá unos marcadores genéticos distintos a los del resto, tendrá sus propios alelos.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples.

La PCR fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo.

La PCR opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de DNA, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento en unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin demasiada formación en biología molecular.

La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación o reproducción del DNA que ocurre de forma natural en las células vivas. La mayor parte del DNA es de doble cadena (es decir, cada cadena de DNA está apareada con otra complementaria). Durante la replicación las dos cadenas se separan y una enzima (una proteína que inicia reacciones químicas) especializada llamada polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas por cada una de las cadenas parentales.

La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar DNA. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de DNA, llamados nucleótidos o bases (ATP, GTP, CTP, TTP). El segundo es un cebador oligonucleotídico o primer. La PCR utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en una ampolla.

La reacción tiene lugar en tres fases: Desnaturalización: la plantilla o fragmento original de DNA se calienta hasta una temperatura de 90º a 95 ºC durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas.

Templado: la temperatura de la mezcla se rebaja hasta 55 ºC durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el DNA escindido.

Polimerización: la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75 °C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de DNA.

Estas tres fases tienen lugar en la misma ampolla y constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de DNA.

La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de PCR resultaba fácilmente destruida por el calor, lo que obligaba a añadir más enzima en cada ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera fase. Pero en las versiones modernas de la PCR se utiliza una polimerasa termoestable llamada Taq polimerasa, extraida de una bacteria termofila, como ésta proteína no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la PCR, basta con añadirla una vez, al principio de la reacción. La Taq polimerasa hoy en día se fabrica con bacterias modificadas genéticamente.

El uso de la PCR exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mínimas de DNA contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación.

Una vez amplificado el DNA, los fragmentos resultantes son separados por medio de un proceso de electroforesis, proceso en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. La electroforesis consta de las siguientes etapas:

- El DNA extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el DNA en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el DNA en la secuencia 5'-GGCC-3'.

- Tras la digestión del DNA, los fragmentos resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa, que es un carbohidrato extraído de un alga. Durante la electroforesis, las moléculas de DNA, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de DNA, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de DNA de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.

Debido a que se analizan regiones polimórficas que varían de un individuo a otro según la distribución de nucleótidos estas describen distintos distribuciones de las

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