Metodo de sanger. Relación de Frentes obtenidas del cromatograma

Objetivo:

Determinar la secuencia N- amino terminal del aminoácido, componente sillar de la hemoglobina realizando el método Sanger. Comprender las condiciones y pasos debidas a realizar para mayor eficacia y su importancia biológica- molecular.

Resultados:

Imagen 1. Cromatograma

Muestras Distancia recorrida por el soluto Rf

Valina 20.6 0.7128

Alanina 17.1 0.5916

Asp 22.3 0.7716

DNFB 13.4 0.4636

problema 11.9 0.4117

problema 19.5 0.6747

Tabla I. Relación de Frentes obtenidas del cromatograma

La distancia recorrida por el eluyente fue de 28.9 cm. Rf=ds/de

Discusión de Resultados

Obtuvimos la secuenciación terminal del grupo amino, realizándolo en un medio básico para la desprotonación del NH3 del aminoácido y así mismo que ocurra la reacción dinitrofenilada. El HCl 6N su objetivo fue realizar la hidrólisis ácida para separar los compuestos dinitrofenilados y aminoácidos libres y así ser extraída e identificada en el cromatograma. Observando el cromatograma y analizando los resultados de los Rf y comparando los valores de los 4 DNP con el valor de Rf problema nos dimos cuenta que el que la valina es el que más se acerca al del problema, con esto podemos decir, que la valina es el aminoácido con grupo alfa amino terminal de la proteína de Hemoglobina.

Conclusiones

- Se conoció el método de Sanger y se observó una desventaja y es la cantidad de tiempo que lleva realizarlo.

-Identificamos el aminoácido alfa-amino de la hemoglobina obteniendo la valina.

-Se analizaron los pasos a realizar para obtener mejor comprensión de su uso.

Pregunta extra. Comparar y buscar el método de Edman de secuenciación de proteína.

Método de Edman (Reactivo: fenilisotiocianato)

Método de Sanger (Reactivo: 1, fluoro2-4 dinitrobenceno)

Da por resultado la liberación del residuo N terminal modificándose sin romper ningún otro enlace peptídico. Puede ser aplicado sucesivamente sobre el polipéptido acortado en el paso anterior ( degradación sustractiva de Edman 3,4,5…) La unión entre el grupo DNP y el aminoácido no se rompe por hidrólisis ácida suave, el derivado de DNP del aminoácido que corresponde al extremo amino terminal puede ser identificado por cromatografía iónica.

Bibliografía

Peña Díaz Antonio.(2004).Bioquímica. Limusa.2° Edición. México. Página 84.

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