Metodo De Sanger

Introducción

El análisis de residuos terminales es la identificación de los residuos de aminoácidos en los extremos de la cadena peptídica. Los procedimientos utilizados dependen del hecho de que los residuos de ambos extremos son diferentes a todos los demás y, además, distintos entre sí: uno el N-terminal, contienen un grupo amino alfa libre y el otro, el residuo C-terminal, contiene un grupo carboxilo alfa con respecto a la unión peptídica, también libre.

Un método muy apropiado para identificar el residuo N-terminal, introducido por Frederick Sanger en 1945, utiliza el 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB), que sufre una sustitución nucleofílica por el grupo amino libre, para dar un derivado N-dinitrofenilado (DNP). Se hidroliza el péptido sustituido, con lo que se liberan los aminoácidos que lo constituyen, y se separa e identifica el residuo N-terminal marcado con el grupo 2,4-dinitrofenilo.

Reacción de Sanger

Objetivo

• Identificar el grupo amino terminal de la hemoglobina mediante el método de Sanger.

Análisis de la técnica

Se colocó en un tubo hemoglobina que es la muestra a analizar y se le agregó NaHCO3 para alcalinizar el medio y desprotonar al grupo amino terminal de la hemoglobina.

Después se le agregó DNFB que reacciono con los grupo amino libres de la proteína formando los dinitrofenilderivados (DNP) y se mantuvo en agitación.

Después se le agregó HCl 3N y se mantuvo un pH de 3 para detener la reacción y que los grupos amino puedan protonarse para que ya no puedan reaccionar con el reactivo de Sanger.

Después se realizaron extracciones con éter saturado con solución acuosa de FeSO4 para quitarle el carácter explosivo al éter. Con las extracciones se elimina el DNFB que no reacciono.

Se colocó el tubo en un baño María para evaporar los residuos de éter y se centrifugo la proteína.

Después se le agregó HCl 6 N por 3 horas a 121°C a15 libras por pulgada cuadrada de presión para llevar a cabo la hidrolisis de la proteína y romper los enlaces peptídicos.

Posteriormente Se hicieron extracciones con éter para eliminar los aminoácidos que no reaccionaron con el DNFB y los DNP derivados no terminales que quedan en la fase acuosa.

Finalmente se realizó una cromatografía para la identificación del aminoácido terminal de la hemoglobina

Resultados

Tabla 1. Valores de Rf obtenidos en el cromatograma

Sustancia Rf

DNP-Glu 0.7631

DNP-Ala 0.6532

DNP-Val 0.7349

Problema 0.6543

DNFB 0.5670

Cromatograma

Discusión

Se realizó una cromatografía para identificar el aminoácido terminal de la sustancia problema que era la hemoglobina y se comparó con dinitrofenil derivados para poder compararlos y determinar el aminoácido terminal correspondiente.

Se tuvieron

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