DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE SANGER

DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE SANGER

Nombres: López Preza Félix Iván, Elizalde Cárdenas Alejandro

Sección 1 Grupo: 3FM2

Introducción:

El aminoácido N-terminal de una cadena polipeptídica, convencionalmente el primer aminoácido, se señala haciendo reaccionar la cadena polipeptídica con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) o reactivo de Sanger, en donde el cual el 2,4-dinitrofenil-derivado resultante se somete a hidrolisis acida, en presencia de HCl 6N, durante la que se hidrolizan los enlaces peptídicos de la cadena, mientras que permanece intacto el enlace del primer aminoácido con el grupo 2,4-dinitrofenilo. El derivado correspondiente al primer aminoácido, de color amarillo, se separa fácilmente del resto de los aminoácidos del hidrolizado, y se identifica por cromatografía, utilizando como patrones los dinitrofenil-derivados sintéticos de los diferentes aminoácidos.

Objetivo:

Identificar el aminoácido alfa amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina bovina mediante el método de Sanger.

Análisis de la técnica:

Primeramente, se colocaron 30 mg de la hemoglobina en un tubo con tapo de rosca, posteriormente se añadió 2.4 mL de bicarbonato de sodio al 4.2% y se disolvió la proteína, con el propósito de mantener el medio con un pH entre 8 y 9, en donde se llevaría acabado la desprotonación del grupo amino. Consecuentemente, se añadió 2 mL de la solución de DNFB y se mantuvo en agitación constante por una hora, con el fin de llevar acabo la dinitrofenilacion.

Después, se ajustó el medio a un pH acido (por debajo de 3) con 15 gotas de HCl 3N.con el fin de detener la dinitrofenilacion, se llevaron a cabo 4 extracciones con 5 ml de éter saturado con FeSO4 cada una. Eliminando en cada una los extractos etéreos, que, por densidad, quedaron en la parte superior. Se eliminó el éter sobrante llevando el tubo a baño María.

Se colocó el tubo en la centrifugadora a 3000 rpm durante 15 minutos, y se eliminó el sobrenadante y posteriormente se añadieron 5 mL de HCl 6N para

después, colocarlo en la autoclave a 15 lb/in2 aproximadamente a 121°C durante 3 horas. Estas son las condiciones para llevar acabo la ruptura de los enlaces peptídicos de la hemoglobina.

Después de las 3 horas en la autoclave, se añadió en el tubo 5 mL de agua destilada, y se extrajo el hidrolizado 4 veces con 7 mL de éter cada vez. Al terminar las extracciones, se desechó la parte acuosa la cual quedo en la parte superior, y se llevó el tubo a la parrilla para calentar los extractos etéreos a sequedad. Al terminar se dejó enfriar y se añadió 0.5 mL de alcohol absoluto.

A continuación, se llevó acabo la cromatografía en un a tira de papel Whatman, de trazaron 3 líneas paralelas a 2.5 cm, a 6.0 cm y 8.0 cm a partir de unos de los extremos. La línea de aplicación fue la línea de 8 cm, donde se colocaron muestras de DNP-Phe, DNP-Al, DNP-Val, DNFB y la muestra que obtuvimos. Posteriormente se colocó el cromatograma en una cámara saturada con ácido cítrico y citrato de sodio 0.1 M a pH 6.4 y se dejó 4.5 horas. finalmente, se sacaron los cromatogramas, se marcó el frente del solvente y se tomaron los respectivos Rf de cada muestra.

Resultados:

 Tabla 1: Valores Rf

X= Distancia de la línea de aplicación a la marca (cm)

Y= Distancia de la línea de aplicación al frente del solvente (cm)

Discusión de resultados:

En los resultados del esquema del cromatograma expresados en la tabla (ver Tabla 1) se puede observar que el Rf de todos los aminoácidos dinitrofenilados está muy lejano al Rf de la muestra problema, esto nos indica que ninguno de esos compuestos es el aminoácido N-terminal de la hemoglobina bovina, en cambio si observamos el Rf de la valina podemos notar que se encuentra aproximadamente al mismo nivel del Rf de la muestra problema, lo cual nos indica que la valina es el aminoácido N-terminal de la hemoglobina bovina.

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