Metodos De Dilucion

MÉTODOS DE DILUCIÓN

Las primeras determinaciones se realizaron empleando una cantidad considerable de tubos con caldo de cultivo, a los cuales se le colocaban diluciones crecientes de antibióticos. Este procedimiento se denominó macrodilución en caldo. Esta metodología es muy difícil, por la cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realización. La aparición de un sistema de inoculación múltiple para placas de agar popularizó el método de dilución en agar, en el que cada placa, con una cierta concentración de antimicrobiano, permite inocular simultá-neamente un gran número de microorganismos. La utilización de micropipetas y de placas de microtitulación facilitó la utilización del método de microdilución en caldo; en la actualidad se han popularizado los métodos automatizados comerciales de microdilución en caldo, fácilmente integrables en sistemas semiautomáticos de lectura e interpretación de resultados, pero con el grave inconveniente del incremento de su costo.

MACRODILUCIÓN EN CALDO

Las pruebas de dilución han sido utilizadas durante años. Los procedimientos iniciales eran realizados en tubos de ensayo grandes (13 por 100 mm) con volúmenes de caldo de por lo menos 1 ml. Este método fue estandarizado en la década de los años 70 por el Estudio Cooperativo Internacional y luego la NCCLS (El Comité Nacional para la Normalización de Laboratorios Clínicos: Es una organización educativa que enseña a través de foros el desarrollo, promoción y uso de normas nacionales e internacionales relacionadas con las pruebas de susceptibilidad,) publicó un estándar del método. Este método es llamado macrodilución en caldo. A partir de los años 60 se comenzaron a utilizar dispositivos serológicos para dispensar y diluir. Esta miniaturización simple de la técnica se conoció como microdilución en caldo.

Fundamentos: Consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes concentraciones de antimicrobianos, en diluciones a la mitad y observar el crecimiento de los microorganismos para luego definir la CIM.

Materiales y métodos: En el método de macrodilución se emplea por cada combinación de microorganismo con antimicrobiano, un juego de tubos. Habitualmente se prepara el juego de tubos con 1ml de caldo MH suplementado con Ca++ y Mg++ estéril sin antimicrobiano.

Para un pequeño número de pruebas se preparan diluciones al doble directamente en los tubos, del modo siguiente.

• Se colocan 2 ml de solución de antibiótico en el primer tubo de la serie de diluciones.

• En cada uno de los tubos restantes se añade 1 ml de caldo MH.

• Con una pipeta estéril se transfiere 1 ml del primer tubo al segundo.

• Después de mezclar el contenido del segundo tubo, se transfiere 1 ml con una pipeta diferente (en esta transferencia y en todas las sucesivas) al tercer tubo.

• El proceso continúa hasta el penúltimo tubo, al que se le quita 1 ml, que se descarta.

• El último tubo no recibe solución de antibiótico y sirve de control de crecimiento.

• Las concentraciones finales de antibióticos en esta prueba son iguales a la mitad de la serie inicial de dilución, debido al agregado de una concentración igual de inóculo en el caldo.

• Se prepara un inóculo bacteriano que contenga 105 a 106UFC/ml ajustando la turbidez de un caldo de cultivo al estándar y diluyendo luego a 1:200 en caldo.

• Añadir a cada tubo 1 ml del inóculo ajustado.

• Incubar los tubos a 35°C entre 16 y 20 horas.

LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LA CIM

La CIM corresponde a la mínima concentración de antibiótico en donde no se observa desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en µg/ml. Luego se debe recurrir, teniendo en cuenta el valor de CIM obtenido para esa cepa, a las tablas para definir según los valores de CIM que en ellas aparecen si las cepas en estudio son sensibles o resistentes a un determinado antibiótico.

Interpretación de los estudios de sensibilidad antibiótica

Los resultados de sensibilidad serán interpretados de acuerdo a las tablas de la NCCLS. Se definen tres categorías: resistente, intermedio y sensible.

El resultado sensible significa que hay una alta probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el antibiótico testado. El resultado resistente implica alta chance de falla terapéutica. La categoría intermedia puede tener varios significados.

Con agentes que se puede administrar a altas dosis, puede significar que se deben utilizar altas dosis para que el tratamiento sea eficaz o que el agente puede ser eficaz si se concentra en el sitio de infección. También puede representar una zona buffer que impide que cepas con sensibilidad borderline sean categorizadas como resistentes.

Los breakpoints o puntos de quiebre son los valores de concentración que permiten la categorización en sensible, resistente o intermedio. Para establecer el valor de estos breakpoints se utilizan cuatro fuentes:

1. La observación de la distribución de CIM que indica como se comportan la mayoría de las cepas y si hay distribuciones anormales que pueden marcar la presencia de un mecanismo de resistencia.

2. La respuesta clínica y bacteriológica a la utilización del antibiótico en cuestión. Se espera una tasa de respuesta favorable del 80% para que el organismo sea clasificado como sensible.

4. Una vez se establecen los breakpoints para CIM se deben elegir los breakpoints para la disco difusión. Esto se obtiene mediante una regresión lineal.

MICRODILUCION

La prueba de microdilución en caldo de CIM se realiza en una placa de poli-estireno. Una placa puede contener de 7 a 8 diluciones de 12 diferentes agentes antimicrobianos. Una celdilla sirve como control positivo (caldo más inóculo), y otro sirve como control negativo (sólo caldo).La mayoría de los sistemas tienen un volumen de 0.1 mL en cada celdilla.

Para facilitar el uso de agentes antimicrobianos apropiados contra cepas específicas, un laboratorio por lo general tiene un tipo de placa para bacterias gram-positivas y otro para bacterias gram-negativas. Para probar cepas aisladas de orina, algunos laboratorios tienen un tipo diferente de placa que contiene medicamentos apropiados para tratar infecciones de las vías urinarias bajas. Para probar bacterias fastidiosas se requieren paneles con medios especiales.

El caldo Mueller-Hinton se recomienda como el medio preferido para pruebas de susceptibilidad de organismos comúnmente aislados, aeróbicos o facultativos de rápido crecimiento. El caldo debe tener el contenido

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