Métodos Microbiológicos

Métodos Microbiológicos (Ref. #1)

 Pruebas de sensibilidad antibiótica

Las técnicas ordinarias de difusión para la determinación de la sensibilidad a los antibióticos de organismos aislados de especímenes clínicos han sufrido las dificultades de estandarización. No obstante las técnicas han sido mejoradas de manera constante.

La técnica de difusión clásica exige que se aplique una fuente del agente antimicrobiano a la superficie de un medio solido. La difusión del agente a través del medio inhibe el crecimiento de un organismo sensible que crezca en o sobre de él hasta un grado determinado parcialmente por la receptividad del organismo. Sin embargo se sabe que un cierto número de otros factores pueden afectar el tamaño de las zonas de inhibición y que estos factores deben ser controlados.

Los factores que afectan el tamaño de las zonas de inhibición son:

 Los componentes de la zona de cultivo: las peptonas, triptonas, extractos de levadura y agar. Pueden variar en su contenido mineral y se sabe perfectamente que el calcio, el magnesio y el hierro modifican el tamaño de las zonas de inhibición, disminuye la actividad de los aminoglicósidos y aumenta el efecto del ácido fusídico. Los carbohidratos pueden aumentar la acción de la furantoína o de la ampicilina. Las dos sustancias que se sabe ocasionan una disminución en la zona de inhibición son la p-aminobenzoico y la timidina (componentes de algunos medios de cultivo).

 Elección del medio: se obtienen resultados consistentes y reproducibles cuando se utilizan medios ideados especialmente para ensayos de sensibilidad (agar de Mueller-Hinton). De manera ideal, las placas deben llenarse en posición horizontal, con un espesor uniforme del medio por toda la placa. No dan buenos resultados las placas muy delgadas o muy gruesas.

 Efecto del pH: la actividad de los aminoglicósidos se ve aumentada en un medio alcalino y disminuida en medios básicos. Para las tetraciclinas el efecto es inverso. El dióxido de carbono en la atmósfera de la estufa o la presencia de carbohidratos fermentables en los medios de cultivo pueden también inducir condiciones ácidas.

 Tamaño del inóculo: las siembras densas disminuyen en algún grado las zonas de inhibición. El inóculo ideal es el que da lugar a un crecimiento uniforme y denso sin ser confluente.

Los cultivos en caldo y las suspensiones adecuadas del germen en medios sólidos pueden diluirse exactamente para obtener un inóculo óptimo. En la práctica pueden obtenerse buenos resultados tomando un asa de cultivo bien desarrollado o haciendo una suspensión adecuada del organismo y extendiéndolas con un hisopo estéril seco.

 Pruebas de sensibilidad directa: las pruebas de sensibilidad pueden realizarse sobre cultivos primarios, estás pruebas permiten dar un informe con 24 horas de anticipación. Las colonias semejantes sobre los medios de cultivo primarios pueden presentar poblaciones claramente diferentes. Es de esperarse que exista la posibilidad de que se esté trabajando con un cultivo mixto en el que se encuentre un organismo productor de penicilinasa que “proteja” a otros gérmenes sensibles contra la acción de un antibiótico que sea sensible a la penicilinasa. Los estafilococos productores de penicilinasa se reconocen por lo general por que los bordes de las zonas de inhibición que producen no muestran tendencia a producir colonias más pequeñas en la proximidad del disco y son apiladas y puntiagudas. Por ello, “cualquier germen importante que se halle presente en compañía de un productor de penicilinasa debe subcultivarse y llevarse a cultivo puro”.

 Ejecución de las pruebas de difusión

Concentración de antibióticos

Actualmente hay poco acuerdo en relación con la concentración de los discos de antibióticos a utilizar en los ensayos de sensibilidad in vitro. Se dispone de tablas que proporcionan las concentraciones recomendadas en los discos, que varían de acuerdo con el método de interpretación que se va a utilizar.

Conservación y aplicación de los discos

Las condiciones de conservación son muy importantes si se han de obtener resultados reproducibles. Los discos deben conservarse siempre en lugar fresco y seco y deben aplicarse con presión al medio para asegurar un contacto adecuado y por tanto una difusión uniforme. Para ello deben emplearse unas pinzas de puntas finas y aguja de disección.

Tiempo de incubación

De manera ideal el tiempo de incubación debe ser el mínimo requerido para el crecimiento del organismo (24hrs a 37°C) y de acuerdo con la rutina diaria del laboratorio. La incubación prolongada puede determinar la destrucción del antibiótico y el crecimiento posterior de los organismos a lo que se ha impedido la multiplicación, pero no han sido muertos.

Técnica de kirby-Bauer

Se utiliza agar Mueller-Hinton en placas de 5-6 mm de grosor para discos de contenido elevado. Se aplican con hisopos de algodón hidrófilo (de garganta) inóculos cuidadosamente estandarizados para que den un crecimiento confluente. Se leen los diámetros de zona y se consultan las tablas que indican el punto de rotura para el antibiótico. Si no se reproducen las condiciones exactas de la prueba, las tablas pueden obtenerse en el mismo laboratorio. La sensibilidad de un germen se indica como sensible, intermedia o resistente.

Recuento de microorganismos viables tras diluciones seriadas

Una simplificación sencilla para el recuento bacteriano la ofrece la estandarización de McFarland, útil en análisis microbiológicos sencillos La escala de McFarland relaciona la turbidez de unos patrones de sulfato bárico con el número de bacterias presentes en una muestra. La turbidez producida por cada mezcla de BaCl2 y H2SO4 ha sido calibrada para aproximar un cierto número de bacterias por unidad de volumen. En otras palabras, la turbiedad que resulta al agitar bien una de estas probetas se aproxima a la turbiedad producida por un cierto número de bacterias en suspensión.

Escala de McFarland

BaCl2 1% (mL)

H2SO4 1% (mL) No. Aproximado de bacterias representado ×106UFC/mL

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