Métodos de estudio en Biología Celular

Tema 2-Métodos de estudio en Biología Celular.

1. Microscopía

1. Microscopio óptico

Está formado por un sistema óptico, un sistema mecánico y un sistema de sostén.

Sistema óptico: Funciona gracias a una fuente de luz, una bombilla, situada en la base, y por encima de la cual hay una lente que dirige los rayos a un condensador, que condensa el rayo en el punto donde está la preparación y tiene una palanca para abrir y cerrar el diafragma limitando el haz de luz (aumenta o disminuye el contraste). La luz atraviesa la preparación y llega al objetivo (aumenta), que está en la zona inferior de un tubo que posee en su parte superior el sistema ocular, por encima del cual está el observador, así el haz de luz final incidirá en su retina y verá la muestra invertida.

[pic 1]

Lo importante en un microscopio no son los aumentos, sino el poder de resolución que es la capacidad de ver dos puntos que están muy juntos como separados y viene dado por la  λ de la luz invisible (λ = Longitud onda; AN = Apertura numérica – a mayor AN, mayor poder de resolución; δ = Poder de resolución). Si el valor de δ es menor a 0.2 µm, no podemos verlo en el microscopio (por ejemplo, las membranas oculares).

λ

                              δ =                = 0.2 µm                                      [pic 2]

2 x AN

Sistema mecánico: Tiene una base donde está el sistema de iluminación. Encima está la platina, donde se coloca la preparación. Debajo de la platina está el sistema ocular y encima de la preparación se encuentra el objetivo, que suele estar incluido en un revólver (gira para conseguir el aumento deseado). En la parte superior del microscopio (cabezal) hay un prisma de vidrio que permite evitar la aberración cromática y angula el rayo de luz para que pase a los oculares (que se pueden separar, y se consigue una escala según la distancia interpupilar). Cada objetivo tiene una longitud focal que se consigue girando unos tornillos que mueven la platina hasta el punto deseado. Por otro lado, existen aberraciones esféricas (se ve un cuerpo esférico, se ve nítido el centro pero se desenfoca el exterior) que se solucionan empleando un microscopio plano (PLAN); y cromáticas que se solucionan con microscopios apocromáticos (APO-CROM).

[pic 3]

Sistema de sostén: El estativo, está sujeto a la base, es el soporte físico del microscopio y en él están tornillos coaxiales: el mayor permite acercar o alejar la muestra para conseguir el enfoque (macrométrico) y el menor mueve casi imperceptiblemente la platina para conseguir el enfoque perfecto (micrométrico). Además, hay un sistema que permite mover la preparación en la platina: encima de la platina hay una placa con una pinza que mantiene la muestra; así, en el lateral de la placa hay 2 tornillos que permiten mover dicha placa en los planos x e y, colocando la muestra debajo del objetivo. La muestra se coloca entre dos cristales, el portaobjetos y el cubreobjetos: El cubreobjetos queda por encima, ya que es mucho más fino y permite enfocar.

[pic 4]

En los microscopios de mayores aumentos no se consigue ver nítida la preparación ya que la luz atraviesa vidrio (porta) y aire hasta llegar a la lente del objetivo, y al atravesar medios con distinto índice de refracción el haz de luz se desvía. Para evitar eso se sitúa entre la lente frontal y el cubre una sustancia líquida (sustancias sintéticas o aceite-si es aceite, en el objetivo pone OIL) con el mismo índice de refracción del vidrio. Los objetivos preparados para ello son objetivos de inmersión.

1. Microscopio de fluorescencia

Es otro microscopio óptico al que se le añade una epiiluminación, de forma que se ilumina por encima de la preparación con una lámpara ultravioleta.

Se emplea en técnicas de inmunohistoquímica, en las que al iluminar los cromóforos adheridos a los anticuerpos con la lámpara UV, éstos emiten una fluorescencia cuando se le añade a la preparación el antígeno correspondiente. Para establecer la λ se ponen unos filtros a la luz UV, que permiten ver sólo un cromóforo.

1. Microscopio confocal

Es un microscopio que emplea un rayo láser que sale del objetivo atravesando la preparación y realiza un barrido de la preparación, por lo que permite observar cromóforos con distintas longitudes de onda, ya que hay sensores que detectan los diferentes barridos y los acoplan informáticamente. El láser puede barrer muestras gruesas ya que hace barridos en distintos planos proporcionando una imagen en 3D.

1. Microscopio de contraste de fase

Sólo se deja pasar un plano de fotones de forma que se consigue una imagen 3D de calidad.

1. Microscopio electrónico

1. Microscopio Electrónico de Transmisión (T.E.M)

Ruska (en 1930) pensó que si se empleaban electrones que atravesaran la preparación en vez de fotones, se disminuiría mucho el poder de resolución y se conseguirían mayores aumentos. Inventó el Microscopio Electrónico de Transmisión (T.E.M). Los fundamentos del T.E.M son los mismos que los del microscopio ótico, exceptuando la naturaleza de la muestra.

[pic 5]

• El emisor de electrones está conectado a la electricidad. Está hecho de un filamento de tungsteno. La diferencia de potencial oscila entre los 80000 y un millón de voltios.
• La lente condensadora (electromagnética) puede variar el ángulo del haz de electrones y tiene la misma función que el condensador del microscopio óptico (condensa el haz de electrones en la preparación).
• Los diafragmas se pueden abrir y cerrar, regulando el paso de electrones.
• Debajo de la pantalla de fósforo hay una cámara fotográfica de placas.
• Todos estos componentes están incluidos en un cañón donde se encuentra el vacío, para permitir que los electrones puedan circular.

Los T.E.M suelen tener 120000 v pero con menos tamaño y voltaje la imagen está mejor contrastada.

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