PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO

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INTRODUCCIÓN:          

     La esterilización es un proceso mediante el cual se realiza la eliminación de todas las formas de vida microbiana (bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporas, y virus).

Los utensilios de vidrio deben de esterilizarse lo antes posible una vez que hayan sido perfectamente lavados, pues de otro modo se producirá́ una rápida multiplicación de gérmenes contaminantes, lo cual con toda seguridad alterará los resultados del análisis microbiológico.

     Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe inocular el medio de cultivo elegido (líquido, sólido o semisólido) las muestras dónde se encuentran los microorganismos que van a crecer y multiplicarse para obtener un crecimiento controlado.

Los microorganismos son los seres vivos más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo está el sustrato (fuente de carbono), presencia o ausencia de oxígeno, nitrógeno (proteínas y aminácidos), agua y cofactores enzimáticos (metales como magnesio, manganeso o hierro). Muchos microorganismos sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.

     El proceso de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo (célula) inmovilizada sobre la superficie de un medio sólido y separada del resto de individuos presentes en el cultivo mixto. Esta célula, en las condiciones de crecimiento adecuadas dará́ lugar a una descendencia que resultará en un agrupamiento macroscópico visible y que se llama colonia. Cada colonia contiene millones o miles de millones de células idénticas y con el mismo origen y propiedades. Se puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos a la concentración de células capaces de generar una colonia. El cultivo descendiente de una misma colonia y que en un principio muestra similitudes morfológicas vistas al microscopio se considera un cultivo puro.

     En los primeros tiempos de la Microbiología se utilizaban como sustratos sólidos para inmovilizar los microorganismos patatas o pan, con el inconveniente de la opacidad de estos sustratos. En el laboratorio de Robert Koch se desarrollaron técnicas para solidificar un medio líquido con composición conocida añadiendo una sustancia sin opacidad y con la posibilidad de modificar la composición del medio líquido según los requerimientos nutricionales del microorganismo a aislar.

     La gelatina fue el primer agente solidificante utilizado por Koch, sin embargo, presentaba el inconveniente de que algunos microorganismos son capaces de utilizarla para su crecimiento. Entonces la gelatina fue sustituida por el agar; introducido por Fanny Eilshemius (1881). El agar es un polisacárido que se obtiene de algunas algas rojas y para pasar de sólido a líquido se debe calentar por encima de los 100°C y una vez fundido es mantiene líquido hasta enfriarse a 44°C.

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OBJETIVO:                

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MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO            

• Medios de cultivos
• Balanza
• Vaso de precipitados de 250 mL
• Probeta
• Varilla de vidrio
• Parrilla
• Tela de asbesto
• Placas Petri
• Autoclave
• Frasco para esterilizar
• Matraz de 250 mL
• Mechero Fisher o Bunsen
• Encendedor
• Etanol al 70%
• Asa de microbiología
• Muestra biológica

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METODOLOGÍA                                            

1. Lavar el material (matraces, cajas Petri, etc.).
2. Dejar escurrir el exceso de agua y enjuagar con agua purificada o agua destilada. Permita que el material escurra sobre una toalla o franela, o simplemente sobre papel absorbente. No debe de secar con ningún otro medio.
3. Permitir que el material seque completamente y proceder a su envoltura (pipetas, cajas Petri) para su esterilización.
4. Esterilizar el material en la autoclave durante 15 min a una presión de 15 lb/in2 (121 °C) cuando el material se humedece se recomienda colocarlo en un horno de secado a una temperatura entre 80 ºC durante una hora, en el cual se deberá́ tener cuidado de que el papel no se queme.
5. Pesar el agar MRS como se indica en las instrucciones del fabricante.
6. Disolver el medio de cultivo en el volumen de agua destilada definido y hervir por 1 min.
7. Transferir con cuidado el medio de cultivo al frasco para esterilizar. Posteriormente esterilizarlo en la olla de presión.
8. Previo a la esterilización, la olla deberá ser llenada con agua destilada procurando no rebasar la rejilla de soporte (aproximadamente ¼ de su capacidad).
9. Una vez colocado el agar dentro de la olla, tapar y calentar monitoreando la presión y el tiempo necesario para la esterilización del medio de cultivo (15 min a 121 °C).
10. Una vez terminado el proceso de esterilización, dejar enfriar el agar (no menos de 40 °C) y verterlo dentro de la caja Petri, colocando la tapa de la caja permitiendo la salida del vapor de agua con el fin de evitar la condensación dentro de la misma. TODO ESTO BAJO CONDICIONES DE ESTERILIDAD. 
11. Para obtener las condiciones de esterilidad primeramente se debe desinfectar el área de trabajo rociando alcohol etílico al 70%, distribuyéndolo con ayuda de una servilleta. Adicionalmente, distribuir los mecheros sobre la superficie de trabajo a una distancia no mayor de 20 cm entre cada una de ellos.
12. Para realizar el aislamiento tanto la muestra a analizar y el resto del material necesario (tubos, placas...) se deben de trabajar dentro del área de esterilidad, evitando tocar los bordes y/o bocas de los recipientes.
13. El asa de siembra se esteriliza al mechero (flamear hasta incandescencia) y después enfriar en la proximidad de la llama (unos 10 segundos), para posteriormente tomar una muestra del alimento modelo y sembrar por estría sobre la superficie del agar solidificado, tal y como se muestra en la siguiente Figura 1.

[pic 1]

[pic 2]

Nota: Si la muestra está en un tubo, quitar el tapón y flamear la boca del tubo.

1. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4 estrías simples de lado a lado sobre agar.
2. Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas.
3. Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
4. Repetir el procedimiento 15 y 16 consecutivamente hasta cubrir toda la superficie del agar.