Práctica 001 (diseño y construccion de biomoleculas i: promotores sinteticos)

Bioingeniería [pic 1]

PRACTICA 001

(DISEÑO Y CONSTRUCCION DE BIOMOLECULAS I: PROMOTORES SINTETICOS)

NOTA: [pic 2]

Integrantes:

Practica 1: Diseño de promotores sintéticos.

Introducción

La temporalidad de la expresión de genes es el mecanismo por el cual la información genética controla el metabolismo celular en los organismos. La expresión genética inadecuada conocida como desregulación genética, puede llevar a enfermedades como el cáncer o la diabetes. La expresión genética involucra la transcripción del DNA en RNA y su traducción a proteínas. Los promotores son secuencias de DNA que inician la transcripción y están entre los elementos más importantes que controlan la expresión de los genes.

El centro de un interruptor genético natural o sintético es la región promotora. El promotor es un fragmento de DNA que posee regiones (cis) topológicamente dispuestas para determinar los niveles de expresión y la temporalidad de la producción de un RNA mensajero mediante la transcripción. Estas regiones son motivos de DNA o “palabras” que se organizan para controlar la afinidad de los factores de transcripción que se unen a estos elementos. Estas regiones o elementos genéticos se denominan motivos cis o elementos cis regulatorios (cajas regulatorias), los cuales han evolucionado para ser blanco de unión de factores de transcripción específicos (STFs) que controlan la producción de un gen. De acuerdo a la temporalidad existen dos tipos principales de promotores: A) Constitutivos: los cuales poseen elementos cis, a los que se unen factores de transcripción abundantes y presentes en todos los tejidos y generalmente en todos los estadios del desarrollo de los organismos. Es por ello, que se dice que siempre se encuentran en modo activo o “encendido”. Generalmente son promotores que dirigen la expresión de genes para rutas metabólicas del metabolismo primario como la glucólisis, que se requieren producir todo el tiempo y en abundancia. B) Inducibles: son aquellos promotores que responden a un estimulo temporal, y los factores de transcripción (STFs) que los regulan y solo responden a dicho estimulo. Este tipo de promotores se inicia solamente cuando el estimulo esta presente, en alguna etapa del desarrollo o es suministrado externamente (inductor). En Biología Sintética el control de un interruptor muchas veces depende de un inductor detectado por un promotor, esto se conoce como “señal sensora” o input. En otras ocasiones son los factores de transcripción que responden al estímulo o molécula externa y se unen al promotor para iniciar la transcripción. Referencias: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2012.05.045 y DOI: 10.1126/science.250.4983.959.

En la presente práctica de laboratorio, diseñaremos promotores sintéticos empleando como base los promotores mínimos descritos para diversos organismos. El promotor mínimo (“core promoter”) es una región cercana al sitio de inicio de la transcripción TSS (+1), que es capaz de albergar a los factores basales y a la maquinaria mínima de inicio de la transcripción (RNA Pol Holoenzima).

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Figura 1A. Arquitectura de un promotor bacteriano (A) y un promotor eucariótico (B).

En la Figura 1, se muestra la arquitectura modular de los promotores, el cual es un diseño evolutivo casi universal. El inicio de la transcripción o TSS posee una región adyacente conocida como “promotor mínimo”. Los promotores mínimos en bacterias tienen una fuerte expresión, en cambio dichas regiones solo inducen niveles bajos de RNA mensajero en eucariontes. Para la biología sintética, el promotor es una entidad de arreglo topológico, de la cual se aprovechan sus propiedades de cooperatividad y sinergismo para diseñar e implementar secuencias promotoras de DNA sintéticas con diferentes eficiencias y especificidades.

Objetivo principal

• Identificar la importancia de los elementos regulatorios de la transcripción y entender el mecanismo de la regulación transcripcional.

Objetivos específicos

• Diseñar promotores sintéticos ortogonales para circuitos genéticos.
• Dominar la metodología para su diseño y construcción.

Metodología

En la presente practica se diseña y construyen promotores sintéticos. El profesor entregara dos plásmidos conteniendo genes para proteínas señal “Output”, pUTEC_green y pUTEC_yellow.

Poseen los genes que codifican para las proteínas reporteras:

> Yellow fluorescent protein (YFP)

MRKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTL

VTTLTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLV

NRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLAD

HYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKRP

AANDENYAASV

>Green fluorescent protein (GFP)

MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTL

VTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLV

NRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLAD

HYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK

NOTA: La secuencia de aminoácidos de YFP y GFP se convirtió a secuencia de DNA (ORFs) empleando Python (PyCharm). Estas se insertaron en el vector pBluescript SK+ en los sitios de restricción XbaI y SacI para producir los vectores pUTEC_green y pUTEC_yellow.  

Actividad 1 (Caja de Herramientas)

Observe en los elementos de la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3. Se provee una lista de promotores para bacterias, plantas y células de mamíferos. Identifique los elementos presentes en cada uno de los promotores. Información adicional de partes y componentes: Promotores constitutivos de E. coli compatibles con Sigma70 (http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Ecoli/Constitutive).

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Figura 2A. En la imagen se representa la secuencia del operador LacO fusionada a un sitio de unión a ribosoma RBS de E. coli.

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