Practica Deteccion De Rotavirus Por Western Blot

Introducción:

La técnica de Western blot es un sistema rápido y muy sensible para la detección y caracterización de proteínas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo. Implica la separación por electroforesis en geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana de las proteínas de una muestra compleja. Los antígenos que se han trasferido a la membrana son reconocidos por anticuerpos monoclonales específicos de ellos.

Western Blot es una técnica importante que se utiliza en Biología Celular y Molecular. Mediante el uso de una transferencia de Western, los investigadores son capaces de identificar proteínas específicas a partir de una mezcla compleja de proteínas extraídas de las células. La técnica utiliza tres elementos para realizar esta tarea: (1) la separación por tamaño, (2) la transferencia a un soporte sólido, y (3) el marcaje de proteína diana utilizando un anticuerpo primario y secundario apropiado para visualizar.

Se puede hablar de dos tipos de Western Blog según el tipo de detección de proteínas: Directo: El anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable. En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con una enzima. Indirecto: El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato. En el método indirecto, se añade primero un anticuerpo primario sin marcar contra el antígeno de la superficie de la membrana; posteriormente se añade un anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo primario.

Para entender la técnica del Western Blot es necesario comprender que es una electroforesis y en que se basa: Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un campo eléctrico a una solución que contenga una mezcla de proteínas, éstas migrarán a una velocidad que dependerá de su carga neta, forma y peso molecular.

En cuanto al patógeno a detectar (indirectamente, pues se buscan anticuerpos contra éste), es el rotavirus, produce una infección intestinal o gastroenteritis, que es la causa más común de diarrea severa en niños, especialmente entre los 6 meses y 5 años de vida. En los casos más graves, la deshidratación generada puede llegar a ser mortal. Los adultos también pueden infectarse, aunque la enfermedad tiende a ser leve, este virus es muy contagioso. Los síntomas son vómitos explosivos, diarrea acuosa a repetición, fiebre y dolor abdominal.

La reacción antígeno-anticuerpo es esencial en la respuesta inmunitaria del cuerpo humano, es la unión específica de un anticuerpo con un antígeno para inhibir o demorar su toxicidad, por lo que la presencia de anticuerpos en una muestra de suero, significa la presencia actual o pasada del antígeno (rotavirus).

Metodología:

SDS-PAGE

1. Preparar un gel de poliacrilamida al 11% (separador), mezclando los reactivos en un vaso de precipitado de 50 ml, en el orden que se indica en la tabla:

Reactivo Cantidad

Acrilamida-Bisacrilamida 30% 1.83 ml

Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 1. 25 ml

SDS 10% 50 l

Agua bidestilada 1.82 ml

AGITAR SUAVEMENTE

Persulfato de Amonio 10% 120 l

TEMED* 10 l

Volumen final 5 ml

2. Depositar los 3 ml de la mezcla de reactivos en el molde para preparar el gel y esperar 10 minutos para dejar polimerizar la acrilamida (cambio de líquido a semi-sólido).

3. Posteriormente, preparar un gel de poliacrilamida al 4% (concentrador) mezclando en un recipiente los reactivos que se indican en la tabla:

Reactivo Cantidad

Acrilamida-Bisacrilamida 30% 0.5 ml

Tris-HCl 1 M pH 6.8 0.37 ml

SDS 10% 30 l

Agua bidestilada 2.02 ml

AGITAR SUAVEMENTE

Persulfato de Amonio 10% 60 l

TEMED* 5 l

Volumen final 3 ml

4. Tomar 1.5 ml de la mezcla y vaciar encima del gel separador, insertar un molde para formar los pozos (peine) donde se depositarán las muestras y dejar polimerizar (aprox. 10 min).

5. Eliminar con papel filtro los restos de poliacrilamida que no polimerizó de los pocillos, y posteriormente trasladar el gel a la cámara de electroforesis vertical.

6. Adicionar 300 ml de buffer de corrimiento 1X (Tris-Glicina-SDS) y conectar la cámara de electroforesis a una fuente de poder para checar que el sistema esté bien ensamblado y haya paso de corriente eléctrica. Ajustar la corriente a 15mA constantes.

7. En un tubo de microcentrífuga de 0.6 ml, mezclar 150 l de proteína recombinante VP4 de Rotavirus más 50 l de buffer carga (Azul de bromofenol-Glicerol-SDS- mercaptoetanol).

8. Suspender la corriente eléctrica un momento, para depositar 16 l de la mezcla proteína-colorante por cada pozo.

9. Continuar con la electroforesis a 15mA constante por 50 min.

10. Cuando el colorante (azul de bromofenol) llegue al extremo final del gel, detener la corriente eléctrica.

11. Teñir el gel de poliacrilamida sumergiéndolo en una solución de Azul de Coomassie toda la noche.

12. Desteñir el gel, retirando la solución de azul de Coomassie y adicionando una solución decolorante (metanol 10%-ácido acético 10%), hasta lograr el contraste deseado.

TEMED*=N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine.

TRANSFERENCIA

Preparar el sándwich (cartucho) para la transferencia utilizando guantes en todo momento de

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