Proteínas: Extracción, cuantificación y análisis de las proteínas de la leche

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Laboratorio 3. Proteínas: Extracción, cuantificación y análisis de las proteínas de la leche

Autores

Juan Mateo Cajamarca Achury (0000215019); juancajac@unisabana.edu.co Juan Camilo Charris Barreto (0000222192); juanchaba@unisabana.edu.co Profesor: Luis Eduardo Díaz Barrera

Fecha de entrega: 24 de agosto de 2021[pic 2]

Abstract

Milk is an emulsion, which principal protein is Casein, that is designed specifically for each mammal species depending on its nutritional requirements. This practice aimed to determine spectrophotometrically the concentration of proteins on 3 types of Alpina cow’s milk () with a calibration curve using Albumin and the isoelectric point of Casein, and the presence of other proteins in the milk with an electrophoresis on polyacrylamide gel with Tris-Glycine as the buffer (SDS-PAGE). The results of the concentration of proteins were not congruent with the nutritional tables given by Alpina due to practical mistakes; the isoelectric point was determined to be between a pH of 4,48 ± 0,29 and 4,79 ± 0,42; and finally, the possible presence of α-lactalbumine, β-lactoglobuline, α2- and β-casein was evidenced in the electrophoretic results.

Palabras clave: Extracción de Caseína, leche de vaca, electroforesis, determinación punto isoeléctrico.

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Introducción

La leche es una emulsión que es única y específicamente diseñada para cada especie de mamíferos en particular dependiendo de sus requerimientos, por lo cual es muy común que la leche de una especie no supla las necesidades nutricionales de otra, incluso hasta el punto de llegar a ser perjudicial para la salud del espécimen (Kumar et al., 2014). La leche de vaca, la cual es ampliamente consumida por los humanos, se puede encontrar comercialmente como: entera, deslactosada (contenido bajo o nulo de lactosa) o descremada (bajo contenido de grasas).

En general, la leche de vaca se compone en un 87% de agua, 3-4% de grasa, 3,5% de proteínas, 5% de lactosa y 1,2% de minerales (Marangoni et al., 2019). Sin embargo, estas cantidades pueden variar dependiendo de la raza, factores climáticos y estrategias de alimentación.

El componente más importante de cualquier leche es la Caseína, esta proteína representa el 80% del nitrógeno presente en la leche y es una fuente rica en aminoácidos esenciales (a excepción de cisteína). La Caseína es un complejo fosforilado y glicosilado sintetizado por las glándulas mamarias, la cual se compone de αS1-, αS2-, β- y k-caseína en proporciones porcentuales de 40:10:40:10,

las cuales están unidas por interacciones no covalentes. Esta proteína está presente en la leche como micelas (le dan a la leche su color blanco), y su función principal es la de transportar compuestos hidrofóbicos como las proteínas, calcio y fosfato en altas concentraciones, los cuales naturalmente serían insolubles en agua, a través de dichas estructuras estables en estado coloidal (micelas) por la interacción de enlaces hidrófilos con el agua (Day, 2015; Sarode et al., 2015).

Como una alternativa a la leche común se encuentra el lactosuero, el cual es representa el 20% de las proteínas de la leche. Este es concurrido por individuos de todas las edades que buscan mejorar su salud, ya que contiene de 3 a 4 veces más Cisteína biodisponible, la cual interviene en la biosíntesis de glutatión, un tripéptido con propiedades antioxidantes, anticancerígenas y de estimulación del sistema inmunológico; además, contiene todos los 20 aminoácidos incluyendo los 9 aminoácidos esenciales y es una fuente rica en aminoácidos de azufre, los cuales tienen un rol antioxidativo. El lactosuero está compuesto por β-lactoglobulina, α- lactoalbúmina, cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas, albúmina de suero bovino, lactoferrina, lactoperoxidasa y glicomacropéptido (Birsen Bulut Solak & Nihat Akin, 2012).

Por otro lado, el punto isoeléctrico es el valor de pH en el cual la carga neta superficial de una especie poliprótica macromolecular es cero (Audain et al., 2016). En este punto, las proteínas poseen la mínima solubilidad debido a que su carga neta cero, por ende, su polaridad es muy baja, lo cual provoca que sean menos afines a compuestos polares como el agua.

Análogamente, poseen una mayor solubilidad en valores de pH altos o bajos debido a que la magnitud de su carga neta incrementa (Shaw et al., 2001), generando un aumento de polaridad, provocando así que sean más afines a compuestos polares.

La Electroforesis es una herramienta analítica efectiva para separación, ya que no afecta la estructura molecular y es sensible a pequeñas diferencias de carga y tamaño moleculares de los analitos, donde el movimiento de las partículas se genera gracias a la influencia de un campo eléctrico (Gummadi & Kandula, 2020). Esta técnica consiste en separar macromoléculas por tamaño, masa y carga a través de un gel que forma un camino para que las moléculas viajen y así, las partículas con menor masa y tamaño viajen más rápido que aquellas con mayor masa y tamaño (Cai, 2020). Este método es utilizado ampliamente para analizar secuencias de aminoácidos y separar proteínas como en el caso de la Caseína en la leche.

Otros métodos que pueden ser usados para la determinación de Caseína en la leche son la espectroscopía de transmisión de infrarrojo cercano (NIR), ya que es rápida, precisa, no destructiva y no requiere preparación previa de las muestras (Laporte & Paquin, 1999); o Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento en Fase Reversa (RP- HPLC), ya que es capaz de recoger información cualitativa y cuantitativa sobre la heterogeneidad de las proteínas debido a su rendimiento analítico y a que se puede acoplar a un espectrómetro de masas (Feligni et al., 2009).

Teniendo esto en cuenta, los objetivos de esta práctica fueron: determinar experimentalmente el punto isoeléctrico (pI) de la Caseína, calcular la concentración de proteínas en muestra problema utilizando espectrofotometría, y conocer los principios de la técnica de electroforesis SDS-PAGE.

Materiales y métodos

Aislamiento de la Caseína

Primero, se calentó en un vaso de precipitados de 250 mL, 50 mL de agua destilada a 38°C, luego, se añadieron 50 mL de leche, y posteriormente, se añadió gota a gota con bureta y agitación magnética ácido acético al 1N hasta observar un precipitado.

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