Quitosano

Abstract-El carácter específico de la actividad quitosanasa de la cepa de Bacillus sp. 739 se determinó. Actividad enzimática máxima se observó en un medio que contiene la biomasa de los cuerpos fructíferos del hongo Macrolepiota procera el. El quitosanasa se purificó hasta homogeneidad por cromatografía en DEAE-Sephadex A. 50 y Toyopearl HW-50 El peso molecular de la enzima evaluada por electroforesis (el procedimiento de Laemmli) se aproxima a 46 kDa. La temperatura y pH óptimos de la quitosanasa purificada estaban en los intervalos de 45-55 ° C y 6.0-6.5, respectivamente. Tiempo a la mitad del máximo inactivación de la enzima a 50 ° C era igual a 1 h.

Con coloidal quitosano como el sustrato, el valor de K de la quitosanasa purificado era igual a 25 mg / ml. La enzima también mostraron una débil capacidad para hidrolizar quitina coloidal.

Quitosanasa (CE 3.2.1.132) hidroliza los enlaces glucosídicos internos en quitosano, que se deriva de la quitina, como resultado de su desacetilación completa o parcial. Quitosanos retención 20-45% de sus restos de acetilo también son hidrolizados por quitinasa (CE 3.2.1.14) y la lisozima (EC 3.2.1.17) [1-3]. La capacidad para efectuar la despolimerización completa de acetil-libres 100% quitosanos sin hidrolizar los enlaces entre los residuos de N-acetilglucosamina es una característica distintiva de chitosanases.

Otra característica importante de estas enzimas es su especificidad múltiple (quitinasas son uniformemente específico). En particular, chitosanases difieren en su capacidad para hidrolizar dos y cincuenta y nueve tipos de enlaces dentro de quitosanos, y esto permite su separación en tres clases difieren en la especificidad del sustrato [4]. Chitosanases están muy extendidos en los microorganismos del suelo, incluidas las bacterias, actinomicetos y hongos [3 - 11]. En ciertas plantas superiores, chitosanases pueden estar implicados en los mecanismos de defensa contra hongos fitopatógenos [12, 13]. Chitosanases microbianos pueden tener utilidades industriales, que incluyen la eliminación de quitosano y la quitina que contiene los desperdicios asociados con el procesamiento de productos del mar y la preparación de moléculas de quitosano de tamaño definido (oligómeros de quitosano utilizado en la industria farmacéutica). Bajo peso molecular quitosanos y chitooligosaccharides puede ser utilizado en la medicina y la agricultura [14-16]. Estudios de chitosanases que difieren en sus propiedades se espera que aclarar el papel biológico de estas enzimas y ayudar en el establecimiento de la estructura de quitosano naturales [17].

Se detectó actividad quitosanasa en la cepa de Bacillus sp. 739 cultivaron en medios que contienen quitina coloidal y quitina sustratos que contienen [18, 19]. En una publicación posterior, se informó sobre el éxito despolimerización quitosano con el complejo quitinolítica de Bacillus sp. 739 Este trabajo fue diseñado para estudiar los efectos de los inductores de diversos orígenes en la formación de quitosanasa por Bacillus sp. 739. Se describen procedimientos de aislamiento y purificación y protocolos para la caracterización de las propiedades físico-químicas y catalíticas de la enzima.

MATERIALES Y MÉTODOS

La cepa Bacillus sp. 739, obtenido a partir de la colección de nuestro instituto, fue descrito primero como un antagonista fúngico exhibe actividades quitinolíticas y la promoción del crecimiento-[18, 21]. El cultivo se mantuvo en un medio de agar que contenía 0,5% de quitina coloidal [18].

Con el fin de obtener una preparación de quitosanasa crudo, Bacillus sp. 739 se hizo crecer en 50 ml de un medio líquido que contiene los siguientes componentes (g / l): almidón de patata, 5,0; peptona, 2,0; extracto de levadura 1,0; extracto de maíz, 0,5; KH 2 PO 4, 1,0, (NH 4) 2 HPO 4,1.0; MgSO 4 7H 2O, 0,5; andCaCl 2 • 5H2 O, 0,3. El cultivo se realizó a 35 ± 1 ¡. y 160 rpm en 250 ml de matraces de agitación durante 48 h. El inóculo se introduce en una cantidad de 1 ml (concentración,

~ 10 6 UFC) en 50 ml de un medio, que tenía la siguiente composición (g / l):. Quitina coloidal, 1,0; coloidal quitosano, 0,5; cuerpos fructíferos del hongo Macrolepiota procera (Fr.) Sing, 1,0; peptona , 1,0, extracto de levadura, 0,5; extracto de maíz, 0,5; KH2 PO 4, 1,0, (NH4) 2HPO4, 1,0; MgSO4 • 7H2O, 0,5; andCaCl2 • 5H2O, 0,3. La fermentación se realizó durante 48 h en las condiciones descritas anteriormente.

Quitina purificada (Sigma, EE.UU.) y práctico quitina grado (Aldrich, EE.UU.) fueron de conchas de cangrejo. Chitosan (Sigma) tenía un grado de desacetilación igual a 85%. Formas coloidales de quitina y quitosano se obtuvieron como se describe en [18]. Los complejos glucano quitina de las paredes celulares de la Helminthosporium micromycete

sativum Pam., King et Bakke., obtenido por el método de [22], y los cadáveres de abejas se utiliza como una fuente de carbono, además de quitina, quitosano, y la biomasa de M. procera.

Quitosanasa actividad se midió con coloidal quitosano como el sustrato (grado de desacetilación, 85%). La mezcla de reacción, preparado por la adición de 1 ml de solución de enzima deEl en 50 mM de fosfato-citrato (pH 6,0) a 0,5 ml de 1% suspensión del sustrato en el mismo tampón, se incubó a 50 ¡. durante 1 h. El contenido de azúcares reductores en el sobrenadante se determinó por el método de ferricianuro [23] utilizando un D-glucosamina (Sigma) gráfico de calibración. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima capaz de formar 1 mmol eq-D-glucosamina por minuto por mililitro de mezcla de reacción.

Aislamiento de quitosanasa de Bacillus sp. 739 se realizó como se describe a continuación. Después de 48 h de cultivo el productor, el sobrenadante del medio de cultivo se recogió y se concentró por ultrafiltración a través de un cartucho de fibra hueca Amicon H1P3-20 (EE.UU.), que mantiene las moléculas de 20 kDa y más grandes. El concentrado se fraccionó con sulfato de amonio (saturación, 20-80%). El precipitado se separó por centrifugación,

volvió a disolver en 25 mM Tris-HCl (pH 7,1), y se dializó durante la noche frente al mismo tampón. El dializado de la fracción de sulfato de amonio (ASF) se centrifugó a 1500 g durante 20 min (para eliminar los componentes insolubles) y se cargó en porciones en una columna de 9.6-11 cm empaquetada con Sephadex A-50 (Pharmacia, Suecia) y se equilibró con 25 mM Tris-HCl (pH 7,1). La columna se lavó con un volumen doble de el tampón de equilibrio (para eliminar las proteínas que escaparon de adsorción), y quitosanasa se eluyó usando un gradiente escalonado de 0.1-0.2 M de NaCl en 25 mM Tris-HCl (pH 7,1) a una tasa de 2,5 ml / min. El eluato se recogió en fracciones de 10 ml. Las fracciones que contienen quitosanasa se

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