REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

Historia

La historia del desarrollo de la PCR es ciertamente curiosa. La técnica tuvo tanto impacto en el mundo científico , que en 1993 le fue concedido el Premio Nobel de Química a su inventor “oficial”, Kary B. Mullis, quien describió el proceso en 1985 y 1988. Sin embargo, catorce años antes (1971 y 1974), el Dr. Molineux, del grupo de Khorana, describió la misma técnica con exquisito detalle, aunque, lamentablemente, consideraron que dicha metodología no era funcional .

Desde su “redescubrimiento oficial” en 1985, la PCR se ha consolidado como la técnica clave de la biología molecular actual, como lo demuestra el número creciente de trabajos científicos que la utilizan.(1)

¿Qué es la reacción en cadenade la polimerasa?

La PCR es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la secuencia deseada del ADN.3,4 La PCR es una técnica de biología molecular altamente específica, rápida, sensible y versátil para detectar cantidades ínfimas de un cierto ADN específico, posibilitando su fácil identificación y prescindiendo del uso de radioisótopos, indispensables antes de su invención. (2)

¿Con qué ingredientes se practica la reacción?

Para realizar una PCR se necesita mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia a amplificar, ambos cebadores que se alinearán a las cadenas simples del ADN, la mezcla de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatados (dNTPs) en cantidades suficientes, el tampón de reacción para la polimerasa, agua ultrapura para completar el volumen final de reacción (que normalmente oscila entre 20 y 100 µl), y como ingrediente final crucial para la reacción, la enzima ADN polimerasa termoestable.

DESCRIPCIÓN DE LA PCR

La amplificación in vitro del DNA se logra en tres pasos básicos:

a).-Desnaturalización del DNA a copiar (molde o diana). Ello se consigue incrementando la temperatura para separar las dos cadenas que componen la doble hélice del DNA.

b).-Hibridación o apareamiento de los cebadores u oligos al DNA molde. Para ello se baja la temperatura de reacción, de forma que pequeñas secuencias de DNA de cadena sencilla (típicamente, entre 10 y 30 bases o meros) se unan a sus secuencias complementarias del DNA diana. Cada uno de ellos se une a una de las cadenas del DNA diana, de forma que sus extremos 3’–OH apuntan el uno hacia el otro, delimitando la secuencia a amplificar.

c).-Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando la temperatura de la reacción a la óptima de la polimerasa de DNA

utilizada. Cada uno de los extremos 3’–OH de los oligos apareados a las cadenas directa y reversa serán extendidos, generándose las cadenas hijas correspondientes. El resultado son dos hélices completas Watson & Crick en la región delimitada por los oligos. Dicho de otra forma, se duplica el número inicial de moléculas de DNA.

Estos tres pasos de desnaturalización, hibridación y polimerización se repiten “n” veces, duplicándose en cada ciclo el número de cadenas delimitadas por los oligos. Se trata, pues, de una amplificación exponencial o logarítmica, en que las cadenas previamente sinterizadas pueden servir de molde a futuras amplificaciones. Por tanto, y mientras los reactivos no se agoten, el numero de moléculas amplificadas responde a la siguiente fórmula:

Número de moléculas finales por cada

...