PCR Reacción En Cadena De Polimerasa

PRÁCTICA PCR

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

I. INTRODUCCIÓN

No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 años ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia Ingeniería genética y a toda la biología molecular. Fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80.

Muchas de las técnicas clásicas de la Ingeniería genética estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cómo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN.

Sin embargo, esas técnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la clonación en un organismo huésped. Esencialmente la técnica permite la amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación selectiva".

La amplificación por PCR se convirtió en una herramienta indispensable. En la clínica, se usa para diagnosticar enfermedades infecciosas y detectar episodios patológicos poco comunes, como las mutaciones que generan cáncer. En medicina forense, el ADN de un solo cabello o del esperma puede amplificarse por PCR de manera que su RFLP, pueda usarse para identificar al individuo. Actualmente las mayorías de las cortes judiciales considera que las secuencias de ADN son una identificación sin ambiguedades de los individuos, al igual que las huellas dactilares, ya que las probabilidades de que los individuos comparan extensas de ADN es prácticamente una en un millón o más.

II. OBJETIVOS

Describir el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.

Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.

Predecir cómo afecta al resultado de la PCR la modificación de factores como la temperatura o la concentración de alguno de los componentes de la reacción.

Preparar una PCR.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombre en inglés Polymerase Chain Reaction) permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonulceico). El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que una enzima polimerasa sea capaz de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Una vez completada la reacción la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante técnicas sencillas de separación de fragmentos de DNA.

Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener muchas copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este fragmento y utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario. Para alcanzar este resultado, los componentes necesarios son:

El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde. Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una DNA polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de la polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).

Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de DNA. Son necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena sencilla. Estas moléculas son los cebadores o primers de la reacción, son los cebadores los que van a delimitar el fragmento a amplificar.

Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).

Estos componentes son los elementos básicos que es necesario incorporar a la reacción para que se complete una PCR.

El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde.

Como veremos a continuación los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los pasos necesarios.

El proceso se lleva a cabo en tres fases: desnaturalización, hibridación y elongación.

En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalización y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC.

El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Esta segunda fase se conoce como hibridación. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC.

Por último, en la fase de elongación o extensión, la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC.

Estas tres fases constituyen un ciclo de la PCR. Tras este ciclo conseguiremos únicamente una copia de un pequeño fragmento del DNA molde. En este primer ciclo, los fragmentos generados no tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de las cadenas se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el que el cebador hibrida con el DNA molde y termina en el momento en el que la enzima polimerasa no es capaz de añadir más nucleótidos (es decir, que la nueva cadena formada no tiene un tamaño definido).

IV. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

4.1 Materiales

Guantes estériles

Pipetas automáticas

Puntas estériles

Tubos de PCR estériles

Gradilla para tubos de PCR

4.2 Reactivos

ADN molde ( Mycobacterium tuberculosis)

Cebadores ( ISS6110, IS

...