Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

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ÍNDICE

INTRODUCCIÓN        

OBJETIVOS        

MATERIALES Y MÉTODOS        

RESULTADOS        

DISCUSIÓN        

CONCLUSIONES        

BIBLIOGRAFIA        

Índice de tablas y figuras

Ilustración 1 Proceso de PCR, Desnaturalización, Alineamiento y Extensión        

Ilustración 2 Copias de DNA generadas por ciclo        

Tabla 1 Composición de la Reacción en cadena de la Polimerasa        

Figura 1 Electroforesis en gel de agarosa 1% de producto de PCR        

INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, por sus siglas en inglés Polimerase chain reaction, es un proceso utilizado en biología molecular para amplificar un segmento de DNA, generando miles de millones de copias de una secuencia especifica de DNA, la técnica fue desarrollada por Kary Mullis en 1983, el método se basa en el proceso de replicación del DNA, proceso en el cual se generan 2 cadenas nuevas de DNA a partir de una cadena molde por acción de proteínas, tales como la DNA polimerasa, la cual tiene la capacidad de agregar nucleótidos a una cadena de DNA preexistente,  para que la DNA polimerasa actué sobre la cadena preexistente requiere de un primer, que es una oligonucleótido corto complementario a la cadena de DNA, a partir del cual puede añadir el primer nucleótido. El requerimiento de primers permite delimitar una región específica de la cadena para que se lleve a cabo la amplificación de una secuencia determinada, esta secuencia se acumulara en miles de millones de copias llamados amplicones.

Para llevar la PCR son necesarios diferentes componentes, los cuales son:

• DNA molde: esta muestra de DNA posee la secuencia que se desea amplificar
• DNA polimerasa: es la encargada de agregar nucleótidos para crear la nueva cadena de DNA a partir de la cadena molde, la enzima más empleada es la Taq Polimerasa, la cual es aislada de la bacteria Thermus aquaticus, esta enzima es utilizada debido a su capacidad de resistir altas temperaturas.
• Primers: estos son pequeños oligonucleótidos de una sola cadena de DNA complementarios a la cadena de DNA molde, la DNA polimerasa sintetiza la cadena de DNA complementaria a partir de los primers. Uno de los factores importantes para realizar una PCR es el diseño de los primers, para lo cual es importante tomar en cuenta ciertos factores:

• Longitud de primer: la longitud optima de primer es de entre 18 y 22 bp. Esta longitud asegura la unión específica y es lo suficientemente corto para unirse fácilmente a la cadena molde.
• Primer Melting Temperature (tm): Es la temperatura ala que la cadena doble de DNA se disocia a cadena sencilla e indica la estabilidad del dúplex. Los primers con una temperatura de fusión de entre 52 y 58°C dan los mejores resultados. La ecuación más simple para calcular la Tm está dada por la regla de Wallace:

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

En donde A, G, C, y T corresponden al número de cada nucleótido presentes.

• dNTPs: los desoxinucleotidos trifosfatados de las bases A, T, G y C, son utilizados por la DNA polimerasa para sintetizar la cadena complementaria de DNA.
• MgCl2: el ion divalente del magnesio (Mg2+) es utilizado por la DNA polimerasa como cofactor para la síntesis de la cadena de DNA complementaria.  

La técnica de PCR consta de 3 pasos:

• Desnaturalización: en este se eleva la temperatura a aproximadamente 94°C para la desnaturalización de las cadenas de DNA y obtener así el DNA en forma de cadenas simples.
• Alineamiento: se reduce la temperatura a un intervalo de entre 40 y 60°C para que los primers se unan a la cadena molde, la temperatura a emplear depende de los primers utilizados.
• Extensión: la temperatura se vuelve a elevar a unos 72°C, que es la temperatura óptima para la actividad de la DNA polimerasa, en este paso se deja actuar a la enzima para que sintetice las nuevas cadenas de DNA añadiendo los nucleótidos de manera secuencia a partir del primer.

Para obtener un gran número         de copias el proceso anterior se realiza en una serie de ciclos, en cada ciclo se generan múltiples copias de la región a amplificar, la amplificación de la secuencia se da de forma exponencial conforme se realizan los ciclos. Normalmente se realizan 35 ciclos.[pic 13]

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OBJETIVOS

Objetivo General:

• Obtener producto amplificado por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Objetivos específicos:

• Conocer la metodología básica para amplificar una cadena de interés por medio de PCR
• Identificar la correcta o incorrecta inserción de una cadena de interés en un vector en base al tamaño del amplificado por medio de PCR

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales:

• Termociclador
• ADN molde
• Tubos de polipropileno de 200 μL
• Oligonucleotidos iniciadores (primers) sentido y antisentido
• Tac DNA polimerasa
• Micropipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 μL
• 10 X PCR buffer
• MgCl2
• dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1mM dCTP, 0.65 mM Dttp
• Mechero Bunsen
• Guantes de latex
• Cubrebocas
• Etanol
• Encendedor

Metodología

1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos Ependdorf en hielo.
2.  Adicionar los reactivos que se indican en la Tabla 1 con las micropipetas (adicionar al final la muestra de DNA)

Tabla 1 Composición de la Reacción en cadena de la Polimerasa

1. Colocar en el termociclador con el siguiente programa:

a) 95ºC 2 min

b) 95°C 30s (desnaturalización),

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