Regulation Of Succinate Dehydrogenase In Escherichia Coli

Succinato deshidrogenasa es la única enzima unida a la membrana o del ciclo del ácido tricarboxílico en Escherichia coli y, por lo tanto, puede participar en la respiración además de funcionar en el ciclo del ácido tricarboxílico. Cambios en el entorno en consecuencia pueden afectar tanto a la actividad respiratoria y el funcionamiento del ciclo del ácido tricarboxílico. Influencia de las condiciones de crecimiento en la biosíntesis y la actividad de los citocromos y deshydrogenases de bacterias está bien documentada unidas a la membrana han sugerido que el sustrato de crecimiento de carbono era importante en el gobierno de la síntesis de la succinato deshidrogenasa en E. coli Este estudio presenta datos adicionales sobre los mecanismos que controlar la biosíntesis de la succinato deshidrogenasa en esta bacteria

MÉTODOS

Organismo y las condiciones de crecimiento. Escherichia coli HfrH, obtenido de JA de MOSS, Universidad de California, San Diego, EE.UU., se mantuvo en agar nutritivo (Difco) y se cultivó en el medio descrito por Sypherd y Strauss (1963) con 5 pug de thiaminelm1 y tampoco me% de glucosa o 0,5% de succinato. Este medio se conoce como 'medio sintético'; por 'medio complejo ", se añadió el caldo nutriente (Difco) al 0,4%. Las bacterias se cultivaron a 37 "C durante 4 a 5 h, el medio se roció con aproximadamente 2 volúmenes de aire estéril / volumen de cultivo / min. Para las condiciones anaeróbicas, los cultivos se roció con una mezcla de 95% de N2 + 5% COz. Densidad bacteriana se midió por medio de un fotocolorímetro Klett utilizando un filtro verde y el contenido de proteína se calculó a partir de la turbidez con una curva de calibración apropiada. 3 M

Preparación de extractos libres de bacterias y sobres bacterianas. Las bacterias se centrifugaron, se lavaron con tampón 0,05 wphosphate, pH 7,3, y se rompieron con un 10 kHz Branson Sonifier (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, Nueva York, EE.UU.) durante tres períodos sucesivos de 15 s cada uno. El extracto se centrifugó a 4008 durante 15 min y el sobrenadante se utiliza como extracto crudo. Sobres bacterianas se aislaron por resuspensión de las bacterias en 0,5 ml de tampón 0,05 M-HCl-Tris, pH 8,3, que contiene 20% de sacarosa y 2 mg de lisozima (Sigma Chemical Co. Inc., St Louis, Missouri, EE.UU.) y se congelaron en Jml una mezcla de acetona-C02 sólido. Después de descongelar a 37 "C, el tratamiento se repitió cuatro veces. Cinco ml de tampón de fosfato 0,05 M-10 que contienen DNasa pg (Sigma Chemical Co.) Se añadieron / ml y se mezcló rápidamente hasta que la viscosidad disminuyó. El extracto crudo se centrifugó a 50000G durante 10 min, se eliminó el sobrenadante y el residuo se resuspendió en I ml de tampón fosfato y se centrifugó a 5008 en un gradiente lineal de sacarosa (50 a 20%) durante 20 min. Sobres bacterianas aparecieron como una banda opalescente dentro del gradiente.

Determinación de la actividad respiratoria. El consumo de oxígeno se midió con un electrodo de oxígeno Clark (Yellow Spring Instrument Co. Inc., Ohio, EE.UU.), unido a una cámara cilíndrica de metacrilato con una capacidad de 2.3 ml.

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Las actividades enzimáticas. Succinato deshidrogenasa se midió por el método de Ells (1959). Tasa de reducción de dicloro-indofenol se midió con un Maroc V (Jobin et Ivon, Arcueil, Francia) espectrofotómetro acoplado a un registrador 43 Photo-Volt Modelo. La actividad se expresó como Be,,,., / Min / mg de proteína. Fumarato hidratasa se midió por el método de Massey (1955), y la actividad expresada como AE,,, / min / mg de proteína. La malato deshidrogenasa se midió como se describe en las enzimas del folleto, reactivos enzimáticos de Worthington Biochemical Corp., Freehold, Nueva Jersey, EE.UU. La actividad se expresó como AE, / mg de proteína Jrnin. NADH deshidrogenasa se midió como sigue: 0,2 ml de 0,0015 M-NADH se mezcló con 2,7 ml de tampón 0,05 M fosfato, pH 7,3, y 0,2 ml de extracto bacteriano. La actividad se midió como se describe para la succinato deshidrogenasa y expresado como AE,, proteína Jmin / rng.

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figura 1

Higo. I. La captación de [1,4-W,] succhate en Escherichia coli. Las bacterias se hicieron crecer durante 4 h en medio complejo solo o con succinato o glucosa añadidos. La captación de [succinato 1,4J'Caj fue seguido como se describe en Métodos. 0. bacterias cultivadas-succinato; 0, bacterias glucosa crecido; x, bacterias cultivadas en medio complejo solos

Sobres bacterianas aisladas oxidan fácilmente succinato y NADH, pero no glucosa.

La oxidación del NADH por sobres de bacterias y glucosa-succinato crecido fue aproximadamente

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