Revisión De métodos Espectroscópicos Y Elaboración De Curva Estándar De Proteína.

*INTRODUCCIÓN.

La espectrofotometría se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en función de la longitud de onda. Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de la luz de una muestra, versus soluciones estándar, es posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra. En general, los espectrofotómetros miden en % de transmitancia (T) y la absorbancia (A), es así que el porcentaje de transmitancia se refiere a la cantidad de radiación que pasa a través de la muestra y alcanza el detector. Con tales datos se puede construir una gráfica para observar como varia la observancia de una especie en solución a una longitud de inda dad en función de su concentración. A esta grafica se le llama curva de calibración o curva estándar, el cual es un marco de referencia construida por cantidades conocidas de una sustancia (albúmina sérica bovina, en nuestro caso) para así medir su absorbancia y medir la cantidad de proteína en una muestra incógnita. Para ello es necesario tomar en cuenta la Ley Lambert – Beer la cual es la relación lineal entre la absorbancia de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, donde:A= Absorbancia; ε= Coef. De ext.; ɩ= long. De la celda dando así la siguiente ecuación A=εɩc+0 siendo esta la ecuación general de la recta la cual representamos como: Y= mx+b

Método de Lowry: Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. Ala muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas. Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno delos enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+proteína tiene un color azul claro. Además provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presente en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotungstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

*OBJETIVO:

 Construir una curva patrón con Albúmina Sérica Bovina (BSA) para utilizarla como referencia en la determinación de la concentración de una muestra problema mediante la Ley de Lambert-Beer.

*HIPÓTESIS

Al ir aumentando el volumen en cada tubo, con albumina sérica bovina (BSA), la lectura de absorbancia para cada tubo ira incrementando, debido a la reaccion del reactivo de Folin-Ciocalteauconlos resíduos de tirosina (Tyr).Esto se vera reflejadoenel aumento de la tonalidade azul de los tubos.

Lasmuestras 9 y 10 que son los tubos que contienen nuestra muestra problema, se obtendran valores de cantidad y concentracion com cuales caeran dentro de los valores de la curva de calibracion.

*RESULTADOS.

Tubo

BSA (μg)

Absorbancia (nm)

Cantidad (μg)

Concentración

(μg/ μL)

1

0

0

-6.6413

-0.0055

2

5

0.227

9.0137

0.0075

3

10

0.268

11.8413

0.0099

4

15

0.357

17.9793

0.0150

7

30

0.546

31.0147

0.0258

8

35

0.555

31.6344

0.0264

9*

25

0.43

23.0137

0.0192

10

50

...