Ruptura Celular

Métodos de permeabilidad de la membrana

Los métodos de permeabilización consisten en alterar la estructura de la pared y la membrana celular para facilitar la difusión del producto hacia el exterior de la célula. Debido a los problemas asociados con la purificación de productos obtenidos por rompimiento celular, existe un gran interés en el empleo de estos métodos alternativos a la ruptura mecánica empleada a nivel industrial.

Existen diversos métodos para alcanzar la permeabilización celular, varios de los cuales son iguales a los empleados en el rompimiento celular pero se realizan a condiciones más leves. Por ejemplo, mediante presión osmótica controlada es posible liberar proteínas localizadas en el espacio periplásmico de células Gram negativas.

Varios de los trabajos sobre permeabilización han sido desarrollados en bacterias gran.negativas, principalmente E. coli, usando solventes como tolueno al 5%, detergentes aniónicos y no iónicos como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y Tritón X-100, agentes caotrópicos como guanidina y urea, y agentes quelantes como el EDTA.

La base de una solubilización efectiva radica en la estructura química del detergente o agente solubilizante. Estas estructuras tienen una porción hidrofilica (generalmente iónica) y una parte hidrofóbica (generalmente un radical orgánico). Como resultado de lo anterior, todos los detergentes son antipáticos, capaces de interaccionar tanto con el agua como con un líquido, esto permite que sean empleados para solubilizar la pared de las bacterias Gram negativas.

La naturaleza anfipática se mantiene si los detergentes son aniónicos, catiónicos o no iónicos. Dentro de los materiales aniónicos se encuentran los jabones los cuales son sales de los ácidos grasos. Debido a que los jabones presentan un grupo carboxílico solo son detergentes efectivos a pH altos, donde este grupo permanece (los jabones no son efectivos en aguas duras, donde los iones de calcio pueden reaccionar con ellos para formar precipitados insolubles). La desventaja de los jabones convencionales como permeabilizantes, puede ser evitada remplazando el grupo carboxilo con un grupo sulfato. El sulfato puede estar ligado a un anillo bencénico formando un sulfonato. Este sulfonato es más efectivo que los sulfatos alcalinos en la ruptura de células; por esta misma razón los sulfonatos no son fácilmente degradados microbiológicamente.

Los detergentes no iónicos comerciales como el tritón X-100 están menos definidos químicamente. Las moléculas de este detergente tienen también una porción hidrofóbica y una hidrofílica. La parte hidrofílica no es un sulfato sino un alcohol. El aspecto importante de estos detergentes es su habilidad para solubilizar lípidos de la pared celular y de esta manera modificar la estructura de la célula.

En soluciones muy diluidas de detergentes, casi no hay disoluciones de lípidos. Existe una concentración a la cual los lípidos repentinamente comienzan a solubilizarse; arriba de esta concentración la solubilidad de los lípidos varía linealmente con la concentración del detergente.

Permeabilizando la célula de E. coli con guanidina y Tritón X-100, en concentraciones de 0.1 M de guanidina y 0.5 % de Tritón, se libera cerca del 50% de la proteína intracelular.

La proteína recombinante b-lactamasa ha sido recuperada con toda su actividad (de E. coli) utilizando una solución 0.2 M de guanidina. A concentraciones de guanidina cercanas a 2 M, las proteínas pueden desnaturalizarse aún cuando este proceso sea irreversible. Se ha encontrado que con la permeabilización con guanidina a concentraciones de 6 M, algunas proteínas como las que se encuentran en cuerpos de inclusión, conservan toda o parte de su actividad biológica. Por esta razón este método de permeabilización celular puede ser muy apropiado para algunos productos recombinantes.

Debido a que la permeabilización química puede ser llevada a cabo en un simple recipiente agitado, sus costos de operación y de inversión son más bajos que los de los métodos de rompimiento celular mecánicos. La principal desventaja de la permeabilización con respecto a los métodos mecánicos y a la lisis enzimática, es que libera menos proteína por unidad de tiempo.

Ruptura celular

El rompimiento celular es una operación unitaria de gran importancia industrial. Algunos de los productos biotecnológicos producidos a escala industrial son extracelulares y no requieren ser extraídos de la célula. Cuando el producto de interés es intracelular, una vez realizada la cosecha de células una operación necesaria para la liberación del producto es el rompimiento

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