TÉCNICA DE WESTERN BLOT WESTERN BLOT TECHNIQUE

TÉCNICA DE WESTERN BLOT
WESTERN BLOT TECHNIQUE

Cárdenas Pérez Sebastián 1, Flórez Camargo Ever 2

RESUMEN:

El Western blot o Inmunoblot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford. Por  Edwin Southern. Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada mediante una electroforesis, en gel se separan las proteínas y son transferidas desde el gel a la membrana electroforéticamente. Se buscó información referenciada para esclarecer y saber en qué consiste esta técnica y en qué momentos se emplea y se encontró que en la actualidad se sustituye por técnicas más económicas y rápidas como el test de ELISA pero no es reemplazada totalmente ya que para obtener un resultado con más precisión los investigadores la emplean, en el área de la Estomatología se usa para determinar malformaciones cráneo faciales con la marcación de genes o proteínas especificas marcadas.

PALABRAS CLAVES: Test, Western Blot, ELISA, Técnica, Marcación de proteínas.

ABSTRAC:

The Western blot or immunoblot was developed in the laboratory of George Stark at Stanford University. By Edwin Southern. It is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample by electrophoresis, gel proteins are separated and transferred from the gel to the membrane electrophoretically. referenced information to clarify and know what this technique and at what times is used and found to now be replaced by more economical techniques and fast as the ELISA test but is not completely replaced because to get a result was sought more precisely the use researchers in the area of Stomatology used to determine craniofacial malformations with gene tagging or labeled specific proteins.

KEYWORDS: Test, Western Blot, ELISA, technique, Dial protein

INTRODUCCIÓN:

El Western blot o Inmunoblot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford Por  Edwin Southern. Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada mediante una electroforesis en gel, se separan las proteínas y son transferidas desde el gel a la membrana electroforéticamente1.

Con esta técnica se pretende identificar proteínas de interés para realizar un estudio determinado2. Para esta se debe tener en cuenta la siguiente secuencia:

• Electroforesis de la muestra con las proteínas,
• Transferir las proteínas desde el gel a membrana de nitrocelulosa.
• Coloración de las proteínas para confirmar transferencia
• Bloqueo de los sitios de unión inespecíficos remanentes en la membrana de nitrocelulosa
• Incubación con el anticuerpo especifico primario
• Lavados del anticuerpo no unido.
• Detección del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados aperoxidasa de rábano picante (HRP)
• Revelado con sustrato quimio luminiscente y detección con placas radiográficas3.

Según Edein Southern el éxito de este ensayo radica en saber manejar a la perfección una electroforesis4 (Técnica utilizada para la separación de moléculas)5.

En el campo de biomédica esta técnica es de vital importancia ya que permite determinar con gran exactitud la presencia de agentes patógenos, condiciones como fenotipo Bombay, pruebas de compatibilidad paterna y materna entre otras6.

MATERIALES Y METODOS:

Computador

Bases de datos (Scielo, Wikipedia, MedLine)

Cuaderno de apuntes

Lápices

Para el desarrollo del informe se utilizó el método de la investigación y la comparación.

Se tomó la información de distintas páginas web de universidades internacionales, nacionales, bases de datos y se hizo una comparación de toda la información recopilada teniendo clara esta información se procedió a tomar los datos más relevantes de la investigación unirlos teniendo como resultado el presente informe.

RESULTADOS:

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras7.

Visión general:

1. Preparación de la muestra: Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química.

1. Electroforesis en gel de Acrilamida: Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a cada una de ellas7.

1. Transferencia electroforética a una membrana: Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas7.

1. Hibridación del Anticuerpo: La membrana con las proteí- nas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma especí- fica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección7.

1. Detección de las Bandas: Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Dicha luz puede ser detectada en una pelí- cula de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario7.

2 Preparación de la muestra:

Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. En la mayoría de ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico7.

A menudo, en muestras tisulares de plantas y animales, se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular, mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes, que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. Las células en cultivo, frecuentemente, se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa, no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. La elección de la substancia detergente, depende en parte de la localización, dentro de la célula, de la proteína de interés, citoplasmática, unida a la membrana, dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias, etc...Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteí- nas del citoesqueleto, afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular7.

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