Southern Blot

Biología molecular - Southern Blot

Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión al nombre del científico inventor de la técnica basada en ADN).

Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones. Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia de determinadas secuencias.

Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas

secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes genes. Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez que la muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una membrana especial donde las proteínas quedan “ancladas” o adheridas. Después, se incuba esta membrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica pueden obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada.

Southern Blot

La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producir fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcaje no-radioctivo).

Southern Blot

El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA,

mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas.

Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación ó enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon. A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente. Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.

Técnica de hibridación de Southern

La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa

...