Western Blot

TÉCNICA WESTERN BLOT

INTRODUCCIÓN

Una parte importante en la investigación es la purificación e identificación de diferentes moléculas biológicas, cómo las proteínas. Las cuales deben de encontrarse libres de contaminantes si se han de caracterizar adecuadamente. La primera etapa es el aislamiento de las proteínas, habitualmente las proteínas son liberadas de las células. El método de elección depende del tejido de procedencia, así como la localización de las proteínas en la célula. Si la proteína se localiza en el citosol, su liberación sólo requiere la apertura de la célula por ruptura (lisis), es el método más sencillo y suave de efectuar. Ya separada la proteína de su entorno natural, debe de controlarse todas las fases del proceso de purificación. Existen diferentes métodos de purificación como por ejemplo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía sobre papel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de resolución elevada (HPLC), la electroforesis, etc.

El Western Blot es un método para identificar proteínas en una mezcla compleja de proteínas, transfiriendo las proteínas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa de unión de las proteínas para su análisis.

MATERIAL Y MÉTODOS.

Extracción de proteína Para realizar electroforesis

Tubos ependorf de 2 ml y 600 l 1 Cámara de electroforesis:

Centrífuga a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC 1 Fuente de poder

1 Juego de micropipetas con puntas 1 Baño María 95 oC.

Hielo

Cámara multipozos o gradilla para ependorff 1 Jeringa Hamilton de 50 l

Tubos eppendorf de 1000, 600, 200 l.

Determinación de proteínas Para realizar el Western Blot

1 Cámara de transferencia: 2 placas de plástico.

2 Cajas de plástico para contener la membrana de transferencia 8.5 X 5.5. cm

4-5 Cajas de plástico para contener los geles, lavar membrana, contener agua y soluciones.

Para realizar 2 geles: 1 Fuente de poder

1 Agitador de placas.

2 Viales con agitador magnético. Regla y lápiz

1 Parrilla con agitación. Hielo

Guantes Papel filtro Watman no. 3

2 juegos de vidrios limpios. 2 peines Membrana de Nitrocelulosa

1 Juego de micropipetas con puntas Tubos para centrífuga de 50 y 10 ml, Costar

SOLUCIONES

Extracción de Proteínas

BUFFER DE LISIS Para 25 ml.

TRIS-HCl 50 mM 0.197 g

NaCl 120 mM 0.1753 g

IGEPAL 0.5 % 0.125 l y aforar

Ajustar pH 8.0 y agregar

NaF 100 mM 0.105 g

NaVO3 200M 0.006 g

Finalmente por 1 ml de buffer agregar 80 l de cocktail anti-proteasas (1 pastilla en 2 ml de agua)

Preparación del Gel

Solución Acrilamida-Bis

Acrilamida 14.6 g

Bis-acrilamida 0.4 g

Agua desionizada 50 ml Solución 1.5 M tris-HCl pH 8.8

Tris-base 18.5 g

Agua desionizada 100 ml

Ajustar a pH 8.8 con HCl almacenar a 4º C

SDS al 10 %

SDS 10 g

Agua desionizada 100 ml

almacenar a temperatura ambiente Solución 0.5 M tris-HCl pH 6.8

Tris-base 6 g

Agua desionizadas 100 ml

Ajustar a pH 6.8 con HCl almacenar a 4º C

Persulfato de Amonio al 10%

Persulfato de amonio 1g

Agua dest. 10 ml

(preparar sólo lo necesario o guardar por 10 días a 4ºC)

Preparación de las muestras de proteínas

Buffer para muestras 4X

Tris-HCl pH=6.8 (0.5 M) 0.6 ml del de 1.5 M

glicerol 0.8 ml

SDS al 10 % 1.6 ml del de 20%

Azul de bromofenol 0.05 % 0.4 ml

-mercaptoetanol 0.4 ml

Agua desionizada 4.2 ml

Almacenar a T° ambiente. 8 .0 ml

Electroforesis

Buffer de corrida

1X 10 X .

Tris Base 3 g 30 g

Glicina 1.44 g 14.4 g

SDS 1 g 10 g

Agua desionizada 1 L 1 L

Transferencia

Buffer de transferencia

Tris-base 03.03 g

Glicina 14.4 g

Metanol 200 ml

SDS 0.5 g

Aforar a 1 litro H2O ajustar a pH= 8.3

Metanol absoluto.

Western Blot

TBS

2.42 g de Tris-HCl (20 mM)

8 g de NaCl (137 mM)

Ajustar el pH a 7.6 Aforar a 1 litro TBS-Tween 20 0.05%

1.0 ml Tween 20 en 1000 ml de TBS.

Albúmina 0.1%

0.4 g de albúmina en 40 ml de TBS-Tween 20 Leche al 5 %

2 g de leche descremadaen 40 ml de TBS-Tween 20

DISEÑO EXPERIMENTAL

I.-Condiciones de cultivo y tratamiento de las células.

1. Se sembrarán 2.5 x 106 células en cajas de Petri de 6 cm2 con medio Williams-completo, dejándolas estabilizar por 24 horas.

2. Después de este tiempo se lavaran las células con PBS. Posteriormente se cambiará el medio por uno libre de SFB por 3-24 horas, pasado este tiempo se retirará el medio y se remplazará con medio sin SFB junto con el reactivo para el tratamiento elegido (etanol, acetaldegìdo, factores de crecimiento, etc.) y tiempo de exposición.

II.- Extracción de Proteínas

1. Las células se lavarán con PBS y se resuspenderán en 250 l de buffer de lisis con inhibidores de proteasas y se incubarán en hielo por 15 min.

2. Después, las células se cosecharan raspándolas y haciendo un homogenado celular, el cual se centrifugará a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC.

3. Recuperar el sobrenadante y tomar una alícuota para cuantificar la concentración de proteína total por el método de Bradford.

III.- Cuantificación de proteínas por el método de Bradford o el utilizado en cada laboratorio.

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