PCR y Western Blot

[pic 1]Benemérita Universidad Autónoma de Puebla[pic 2]

Facultad de Ciencias Biológicas

Estructura y Función Molecular

Dra. Dulce Elena Letras Luna

NRC: 29840

Sección 007

Investigación:

PCR anidada

 y Western Blot

Alumno: Luis Francisco Muñoz Jimenez – 202048778

PCR anidada.

La PCR anidada e comprende  dos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, esto con el fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Para esto primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar la región de ADN más extensa, que contiene el segmento diana y después este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica.

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[pic 4]PCR anidada. Fuente de la imagen: https://www.thermofisher.com/

El primer conjunto de cebadores está diseñado para anidar a secuencias aguas arriba del segundo conjunto de cebadores, y el segundo conjunto de cebadores está anidado con respecto al primer conjunto de cebadores. El primer conjunto de cebadores o cebadores externos amplifican un fragmento grande del gen que se utiliza como plantilla en la segunda ronda de PCR que se dirige a una región más pequeña del amplicón utilizando el segundo conjunto de  cebadores internos o cebadores anidados.

La PCR anidada realiza una serie de ciclos de PCR utilizando el primer conjunto de cebadores, y luego abrir el recipiente de reacción y agregar el segundo conjunto de cebadores anidados para ejecutar el segundo ciclo de PCR. Uno de los problemas con este enfoque es la contaminación por amplicones. Para que este problema no suceda, se han desarrollado reacciones de PCR anidada de un solo tubo (STNPCR), en las que se agregan ambos conjuntos de cebadores al vaso de reacción inicial y se realiza una PCR extendida. (Tankeshwar, 2021)

Los amplicones de estos ensayos de PCR se visualizan cuando se electroforiza la mezcla de reacción en gel de agarosa teñido de bromuro de etidio al 2% junto con un marcador de peso molecular. (Tankeshwar, 2021)

Western Blot.

Western blot se utiliza para separar e identificar proteínas. En esta técnica se separa una mezcla de proteínas en función del peso molecular, y por lo tanto por tipo, a través de electroforesis en gel. Estos resultados se transfieren a una membrana que produce una banda para cada proteína y esta membrana se incuba con etiquetas de anticuerpos específicos para la proteína buscada. (Mahmood & Yang, 2012)

El anticuerpo no unido se lava dejando solo el anticuerpo unido a la proteína de interés. Los anticuerpos unidos se detectan mediante el desarrollo de la película. Como los anticuerpos solo se unen a la proteína de interés, solo una banda debe ser visible. El grosor de la banda corresponde a la cantidad de proteína presente; por lo tanto, hacer un estándar puede indicar la cantidad de proteína presente.

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Teoría de la técnica.

Preparación de la muestra 

La forma más común de muestra para el Western Blot son los lisados celulares. La extracción de proteínas recolecta todas las proteínas en el citosol celular. Esto debe hacerse a una temperatura fría con inhibidores de la proteasa para evitar la desnaturalización de las proteínas. Dado que la muestra de tejido muestra un mayor grado de estructura, se necesita invención mecánica, como la homogeneización para extraer las proteínas. (Mahmood & Yang, 2012)

Es importante tener una buena idea de la concentración del extracto. La concentración de proteínas se mide utilizando un espectrofotómetro.

Se diluye en un tampón de carga que contiene glicerol para que las muestras se hundan fácilmente en los pocillos del gel. Un tinte de seguimiento (azul de bromofenol) también está presente en el tampón, lo que va a permitir ver hasta qué punto ha progresado la separación. Después de todo esto la muestra se calienta después de ser diluida en un tampón de carga, para desnaturalizar la estructura de orden superior.

Para un control positivo se utiliza una fuente conocida de proteína objetivo, como la proteína purificada o un lisado de control.

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