PCR

El detectar errores durante el proceso de PCR Como tal es bastante difícil, principalmente los relacionado con el tratamiento previo de las muestras, es decir la conservación, preparación y adicion adecuada de reactivos a la muestra. Tales errores solo podrán diagnosticase durante la lectura de los resutados. Sin embargo si el termociclador tiene indicadores de temperatura y se pueden ver los errores relacionados con las temperaturas en cada una de las fases del proceso.

Materiales. Calculadora, Cámara de electroforesis horizontal y accesorios, Micropipetas de 1-10 uL, Puntas descartables de 1-10 uL, Lamina de papel parafina, Solución de Agarosa 0,8%, Buffer TAE 1X para la corrida, Fuente de Poder.

Ensamblaje de la cámara de electroforesis. Se colocó la bandeja o cama de la cámara en forma para crear un sello contra las paredes, para así poder verter el gel. Luego de agregar el gel en la cámara, se colocaron los peines en posición y se dejó solidificar. después del proceso de solidificación, se giró 90 ° la bandeja o cama, sin retirar los peines. Se agregó el buffer de corrida (TAE 1X) y se retiraron cuidadosamente los peines. Se tapa la cámara y se conecto a la fuente de poder a un voltaje constante de 90 V, durante 45 min. Constantemente verifique la migración de las muestras en el gel mediante el movimiento del indicador de corrida (Azul de Bromofenol) garantizando de esta manera el buen funcionamiento del procedimiento.

Preparación de el gel de Agarosa. Se preparo un gel de 120 ml, en el cual se realizó utilizando la siguiente proporción 0,9 gr Agarosa/120 ml TAE 1X, la cual fue llevada a un frasco con rosca para aguitar en el proceso de calentamiento en el horno microondas durante dos periodos de 1 min cada uno para disolver la agarosa en el TAE 1X, esta solución es de color lechosa al inicio y se disuelve hasta quedar trasparente. Luego de la disolución, se deja el frasco con la solución que se enfríe durante unos minutos para evitar posibles quemaduras. Porteiormente se vierte el contenido o solución en la cama de la cámara previamente ensamblada y se le agrega una gota de bromuro de etidio y se deja solidificar el gel durante unos 30 minutos.

Coloración y visualización de ADN en geles de poliacrilamida y agarosa usando bromuro de etidio. En una lamina de papel parafina, se preparó el indicador o marcador de corrida/Colorante (Azul de Bromofenol/GelRed 2:1), al cual se agregó alícuotas de alrededor de 2uL de la solución combinada (Ver Imagen 2). A cada alícuota, se le agregó 5 uL de muestra (una gota por muestra). Se mezcla suavemente la alícuota con la muestra (2 uL colorante + 5 uL muestra= 7 uL). Y se siembran los 7 uL del combinado en cada pocillo del gel evitando la rotura o perforación del mismo con la punta de la micropipeta.

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