Influenza RT-PCR

Introducción

La gripe es una enfermedad infecciosa aguda causada por un miembro de la familia Orthomyxoviridae. Hay tres tipos de virus de la influenza tipo A, tipo B y tipo C. los grandes brotes de gripe siempre están asociadas con el virus influenza tipo A o B, especialmente influenza tipo A, virus que ha sido tomado en cuenta para las pandemias en todo el mundo durante el siglo xx (Luk et al. 2001; Oxford 2000). La pandemia más letal de la gripe, conocida como "gripe española", ocurrido durante 1918-1919, y mató a más de 20 millones de personas. En el año 2009, una nueva cepa de H1N1 del virus de la influenza aviar, lo que a menudo se conoce como "nuevo virus influenza A (H1N1) ", causa infección generalizada a millones de personas en poco tiempo y la muerte de decenas de miles de personas (Seth et al. 2010).

El virus de la influenza es un único hilo negativo virus ARN. Su genoma contiene ocho segmentos de genes con excepción de tipo C, que sólo cuenta con siete segmentos de genes. Diez que codifican proteínas, abreviado como PB1, PB2 y PA, HA, NA, NP, M1, M2, NS1, NS2. Los virus de la influenza se clasifican en las categorías A, B y C tipos basados en sus diferencias antigénicas en el NP y M las proteínas. Y las variaciones de la superficie glycoproteins, haemagglutinin (HA) y neuraminidase (NA), determinan los subtipos de gripe un virus responsable de un brote. Corrientemente, 16 HA los subtipos y 9 subtipos de NA han sido encontrados (Fouchier et al. 2005). Las infecciones humanas son causadas principalmente por virus influenza tipo B y tres virus de la influenza A los subtipos H1N1, H3N2, y la novela H1N1 (Xiyan et al. 2004). Los casos de infección humana por el virus de gripe aviar altamente patógena H5N1 del virus se ha registrado también en varios países (Yu et al. 2006; OMS 2010).

Aunque aislamiento del virus en cultivo celular ha servido durante mucho tiempo como el estándar de oro para el diagnóstico del virus de la gripe, el enfoque solo es ineficaz cuando se producen brotes mundo ya que es menos sensible, que requiere mucho tiempo y requiere de una considerable experiencia técnica. Actualmente, no más rápido métodos de cultivo con mayor sensibilidad y especificidad se han desarrollado, como inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático, y métodos de biología molecular, que incluyen RT-PCR en una etapa y en tiempo real de reacción inversa en cadena de la polimerasa (RT-PCR; Van et al. 2001), NASBA (Van et al. 2006), EL FARO (Masahiro et al. 2006; Imai et al. 2006), TMA (Hill 2001), microarreglos (Dawson et al. 2007; Wang et al. 2006), y así sucesivamente. Entre ellos, RT-PCR en tiempo real se ha convertido en la principal técnica de detección viral en el caso de un brote pandémico debido a su comodidad, velocidad y precisión.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas de virus y muestras clínicas

10 Cepas de referencia de subtipo H1N1 11, subtipo H3N2, 1 subtipo H5N1 y 7 tipo B se obtuvieron del Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) de Shenzhen. Cepas de referencia de 20 novela H1N1, 2 adenovirus, parainfluenza 2 III y IV, y el virus sincitial respiratorio 2 fueron gentilmente cedidas por Guangdong CDC. En total, 436 torundas de pacientes con enfermedad respiratoria síntomas en dos Shenzhen hospitales durante el año 2009. Imprimación y diseño de la sonda las secuencias de genes de hemaglutinina (H1, H3, H5) y la neuraminidasa (N1 y N2) del virus de la influenza A los subtipos se obtuvieron de la base de datos GenBank base de datos y se analizaron con el MEGA programa de software (versión 3.1 ; http://www.megasoftware.net). Basado en múltiples alineaciones de secuencia, cinco de los genes cebadores específicos/juegos de sondas dirigidas a consenso las regiones se obtuvieron mediante la imprimación Premier (english version 5.0 ; PREMIER Biosoft Internacional, CA, http://www.premierbiosoft.com). Los cebadores N1 y de la sonda fue diseñado sobre la base de la alineación resultados de más de 100 virus de la gripe A secuencias, incluida la H1N1 y H5N1. El primer par/conjunto de sonda para el NS gen de virus de la influenza B fue modificado a partir de los publicados en Jieet cols. (2009). Secuencia identidad entre pares de iniciadores y sondas se analizó mediante usando BLASTN (versión 2.2.1 ; NCBI, MD, http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Los cebadores y sondas utilizadas en el presente estudio se muestran en la Tabla 1.

Aislamiento del virus y extracción de ARN

Todos los virus de influenza virus referencia fueron cultivadas en 9 a 11 días de edad los huevos embrionados de pollo como se describe anteriormente (Wang, 1999). La referencia de los virus ARN y muestras clínicas fueron extraídos con alta Kit de ARN en virus puro (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se almacenaron a - 80 °C hasta su uso.

Un paso multiplex RT-PCR en tiempo real

En el presente estudio, los dos un solo paso y multiplex RT-PCR en tiempo real se desarrollaron sistemas mediante un paso PrimeScriptΤΜ RT-PCR Kit (Takara La Biotecnología Co. , Dalian, China) y ABI7500 (Applied Biosystems, USA). El duplex RT-PCR en tiempo real que se utiliza para identificar N1 y N2 los subtipos se preparó en un 25- Μl mezcla de reacción que contiene 12,5 ×2 ul de uno paso tampón de RT-PCR, 2,5 U Takara Ex TaqΤΜ HS, 0,5 Μl PrimeScriptΤΜ RT Mezcla de enzimas II, 5 μl ARN muestra, y dos subtipos de cebadores específicos y de la sonda, que está integrado por pares de iniciadores específicos para N1 y N2 los genes a una concentración final de 0,6 μm y su detección las sondas (HEXlabeled N1 y ROX-etiqueta N2) en concentraciones de 0,4 y 0,8 μM, respectivamente. El ciclo incluye parámetros de RTPCR 5 min a 42 °C por transcripción inversa, 10 s a 95 °C para la Taq HS activación, seguido de 40 ciclos de amplificación de 95 °C durante 5 s y 58 °C por 40 s. Fluorescencia se recogieron las señales al final de cada paso de amplificación. En cuanto a la operativa cuádruplex sistema utilizado para detectar H1, H3, H5, y NS genes, con la RT-PCR fueron similares a las condiciones del sistema dúplex, excepto diferentes conjuntos de pares de iniciadores y sondas. Cuatro sondas fluorogénicas específicos para H1, H3, H5, y NS, y los genes marcada de forma distinta con ROX, HEXAGONAL, FAM, y CY5, se utilizaron a concentraciones finales de 0,2 , 0,2 , 0,16 y 0,24 μm, respectivamente. Concentración de los cebadores Final fueron 0,6 micras.

Tabla 1

La reacción se realizó durante 15 min a 42 °C por transcripción reversa, 2 min a 95 °C para la activación de la Taq HS, seguido de 40 ciclos de amplificación de 95 °C por 10 s y 58 °C por 40 s. Los resultados fueron recopilados y analizados mediante la ABI 7000 system

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