Reporte Práctica PCR

Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato

Laboratorio de biotecnología molecular

Reacción en cadena de la polimerasa

Práctica 2

5BM1

Avecilla Ramírez Andrea Melina

Gurrola Reza Yoatzin Uriel

Izaguirre Hernández María Teresa

Oliva González Alexia Sofía

Ramírez Guzmán Lizbeth Alejandra

Valdez Rodríguez Abril

18 de septiembre de 2013

Laboratorio de Biotecnología Molecular

RESULTADOS

• Electroforesis en Gel de Agarosa.

Para verificar que haya ocurrido la amplificación delos fragmentos de DNA deseado,correspondientes a los plásmidos pCD1 y p11,se empleó la electroforesis en gel de agarosa. Los oligos utilizados fueron diseñados para el plásmido pCD1, que era el que se esperaba amplificar, mientras que el plásmido p11 se usó solo como control negativo.

El marcador de peso molecular utilizado fue 1Kb DNA Ladder, catálogo No. 15615-016 (Invitrogen), mostrado en la figura 3.

Fig. 1. Marcador de peso molecular de 1Kb para DNA, usado en gel de agarosa 1%. Fuente: Invitrogen corporation.

Las muestras de los equipos se analizaron en un mismo gel de agarosa, obteniendo lo siguiente:

Fig. 2. Electroforesis en gel de agarosa 1% con muestras del fragmento de 598 pb del gen GFA1 de S. schenckii, amplificado por PCR.En la columna izquierda se encuentra el marcador (M); en las columnas 1, 3, 4, 5, 7, 8 y 9 se muestran los resultados de los otros equipos; en la columna 2 y 6 se observan los resultados de nuestro equipo (recuadros rojos), de las muestras de plásmidos pCD1 y P11, respectivamente. De todas las muestras, sólo una dio como resultado la banda esperada (recuadro verde). Imagen obtenida durante la práctica realizada en el Laboratorio de biotecnología molecular UPIIG-IPN, 11-09-13.

DISCUSIÓN

Para la amplificación del fragmento del genGFA1 del hongo S. schenckii, se emplearon oligonucleótidos específicos, seleccionados a partir de una región del DNA del gen mencionado de S. schenckii(Tabla 1). La secuencia que se deseaba amplificar era de 598 pb, y se muestra a continuación, las zonas de unión de los oligonucleótidos se encuentran coloreadas para su identificación:

CGCTCCATACTAGCCCGTATTCTGTGTTCTTGCTTCCTTCCTCCCGTTCCTGTTTCTCCTTAAATTTGCGTCGTCGCTGCCTCGCTCTTTCCTTCATATTCCCCTCTGTTCATTCATCCTTCTCTTTCCAATTTTGCCCTGGGCAACCGCATCCACCACCCACTTTCAGCCTCGCCCGCCTTCTTCTCACCGTCTCCCACACCTTCACAACTTTACAACCTCACGGCTCACGACACTCGCCGGCAAGATGTGGTACGTACGCTCCGCTTCACCGCTGCTCATGGAGCTGGCCCAAGGGCCAGAGTGAGATTCAGAATTCAGATTGCTGACAAGTTTCTCTTTGCAGTGGCATTTTCGGCTACGTCAGCTACCTGGTGGAGAAGGACCGGAAGTTCATCCTCGACACACTCGTGAACGGTAAGACATCGCCACGATCCTCCCGTCCTTATCGCAGCCACTGCCAAACAAGTAACTGACAGGCGTTCTCTTTCCTAGGTCTGTCTCGGTTGGAATACCGTGGCTATGATTCCGCCGGTCTCGCCGTCGATGGCGACAAGAAGAACGAGGTGTTCGCCTTCAAGGAGGTTGGCAAGGTTGC

Gen Clave de oligos Secuencia de oligonucleótidos T (°C) pb

GFA1SS GFACTA-D 5’ CGCTCCATACTAGCCCGT 3’ 55 598 pb

GFACTA-R 5’ GCAACCTTGCCAACCTCCT 3’

Tabla 1. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación del fragmento de 598 pb del gen GFA1.

Tm significa en inglés melting temperature y se refiere a la temperatura a la que se hibridan o se pegan los oligonucleótidos en los sitios que son complementarios. Este proceso dependerá principalmente del tipo de uniones (dobles o triples enlaces de hidrógeno) que formarán sus bases, y por eso la secuencia de cada oligo es la que se toma en cuenta para conocer cuál es la temperatura óptima para su alineamiento. (Eguiarte et al, 2007)

Existen muchas maneras de calcularla, por ejemplo una sencilla es:

Tm = 4(G+C) + 2 (A+T)

De acuerdo a la fórmula anterior, la Tm promedio obtenido para los 2 oligonucleótidos utilizados es de 59 °C.

Según Coyne et al, 2001, la temperatura de alineamiento elegida para la PCR depende directamente de la longitud y composición del o los oligos; se debe utilizar una temperatura de alineamiento (Ta) alrededor de 5 °C por debajo de la Tm más baja del par de oligos que se utilizarán. De acuerdo a lo mencionado por el autor anterior, la temperatura de alineamiento que se debió utilizar es de 54°C, sin embargo, la empleada fue de 55 °C, la diferencia es únicamente de un grado, así que está temperatura de alineación (55 °C) se considera como la correcta, por tanto no afectó negativamente en los resultados obtenidos.

El uso de la reacción en cadena dela polimerasa (PCR) para generar grandes cantidades de un producto deseado puede ser una espada de doble filo. Si no se amplifican en condiciones óptimas puede conducir ala generación de múltiples productos no definidos y no deseados, incluso a la exclusión del producto deseado. En el otro extremo, puede no generarse ningún producto (Roux, 2009).

De acuerdo a Roux, 2009, la causa de no haber obtenido ningún producto en la PCR puede atribuírsele, a que las condiciones utilizadas durante la práctica no fueron las óptimas, esto se comentará a detalle más adelante.

La reacción de PCR es muy sensible a cambios de iones, temperaturas y contaminantes que pueden estar en el DNA o en el agua. Incluso, de un termociclador a otro puede haber variaciones. (Eguiarte et al, 2007) Algunas de las causas más frecuentes que originan fallas durante la PCR son las siguientes:

• El ADN pudo estar contaminado con proteínas, fenol, cloroformo, carbohidratos o alguna otra sustancia que inhibe la reacción de PCR.

• Los dNTPs son muy inestables, si se descongelan más de 3 a 5 veces pueden no funcionar bien.

• Los oligonucleótidos podrían estar degradados, defectuosos o mal diseñados. (Eguiarte et al, 2007)

De acuerdo a Eguiarte et al(2007), la razón de que no obtuviéramos fragmentos de DNA en la PCR realizada, podría atribuírsele a todos los factores recién mencionados; sin embargo, en el carril de uno de los equipos se logró observar una banda, que, aunque muy tenue, significa que tanto los reactivos como el procedimiento fueron correctos, ya que se realizó de igual manera en todos los equipos. Así pues, es probable que dichos factores afectaran la productividad de la PCR (pues se esperaba observar una banda más gruesa) pero no se consideran la causa de que el resto de los equipos no obtuvieran ningún fragmento de DNA.

También, es importante considerar que las concentraciones de los reactivos pudieron variar por errores de pipeteo o error en el protocolo, una variación en la cantidad de reactivos adicionados puede tener varios efectos, como los que se mencionan a continuación:

o Si hay mucha cantidad de oligonucleótidos aumenta el rendimiento del PCR, pero podrían formarse productos inespecíficos, y si se agrega aún mayor cantidad los oligos pueden formar dímeros, en vez de unirse al ADN, y eso impide la amplificación del producto. Si se utiliza muy poco se podría tener mayor especificidad en el producto, pero puede suceder que no se verá el amplificado (pues baja el rendimiento). (Eguiarte et al, 2007)

o Debido a que los dNTPs quelatan directamente un número proporcional de iones Mg+ +, un aumento en la concentración de dNTPs disminuye la concentración de Mg+ + libre disponible para influir en la función de la polimerasa (Roux, 2009).

o Las cantidades óptimas de la enzima están comprendidas entre 1 y 2.5 unidades para un volumen final de mezcla de 50μL. Una cantidad excesiva puede conducir a la amplificación de productos no específicos (Catasús y Matías-Guiu, 1997)

o El MgCl2 es un factor crítico indispensable en la PCR, ya que influye sobre la hibridación de los cebadores, sobre la especificidad del producto de amplificación y sobre la actividad y fidelidad de la Taq polimerasa. La concentración final de MgCl2 se determina empíricamente y suele situarse entre 1 y 4 mM. La PCR no funciona sin suficientes iones magnesio, pero una cantidad excesiva puede ser el origen de productos amplificados inespecíficos (Catasús y Matías-Guiu, 1997).

A continuación se muestran los componentes estándar de la mezcla de reacción para PCR, la concentración de cada uno de ellos, el volumen requerido para obtener la concentración apropiada (concentración final) en un volumen de 100 μL de mezcla (Tabla 2).

Tabla 2.Elementos para la mezcla de reacción de PCR del manual de la Taq DNA Polymerase (Invitrogen).

Componentes Volumen Concentración final

10X buffer PCR menos Mg 10 μl 1X

10 mM dNTP (mezcla) 2 μl 0.2 mM

50 mM MgCl2 3 μl 1.5 mM

Mezcla de primers (10 μM cada uno) 5 μl 0.5 μM cada uno

DNA genómico 1–20 μl n/a

TaqDNA Polimerasa (5 U/μl) 0.2–0.5 μl 1.0–2.5 unidades

Agua destilada estéril 100 μl n/a

La tabla 3 muestra los componentes de la mezcla de reacción para PCR que se usaron en la práctica, la concentración de cada uno de ellos, el volumen requerido para obtener la concentración apropiada (concentración final) en un volumen de 100 μL de mezcla.

Tabla 3. Elementos para la mezcla de reacción de PCR utilizados en la práctica

Componente Volumen Concentración final

Agua desionizada estéril 18.3 μl n/a

MgCl2 50 mM 2 μl 4 mM

dNTPs 10 mM 0.5 μl 0.2 mM

Oligonucleótido directo 10 μM 0.5 μl 0.2 μM

Oligonucleótido reverso 10 μM 0.5 μl 0.2 μM

DNA genómico 0.5

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