PCR Tuberculosis

Protocolo de Diagnóstico tuberculosis a través de PCR:

Recolección de muestra:

Material necesario: 1.Frasco estéril de boca ancha y hermético 2.Suero fisiológico estéril y nebulizador.

Técnica: Se deberá enjuagar la boca con agua destilada estéril o solución salina, una vez realizado esto se deberá Obtener el esputo tras una expectoración profunda, preferentemente realizarlo en la mañana, en caso de no producirse expectoración espontanea, esta se podrá inducir con nebulizaciones de suero fisiológico estéril.

Procesamiento de la muestra: La muestra se someterá a concentración y descontaminación en forma en una campana con flujo laminar.

Aislamiento de ácidos nucleicos:

1.Se colocaran 100mL de las muestras de espectoracion previamente descontaminadas en un tubo Eppendorf y se centrifugaran por 5 minutos a 14,000rpm.

2. El paquete celular se resuspenderá en 200 mL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8) y50mL de SDS al 10%.

3. Las bacterias se someterán a tres choques térmicos consecutivos, pasándose de un baño de hielo seco-acetona (-70°C) a un baño de agua a 37°C; después del choque térmico se incubaron a 65°C por 30 minutos.

3. Al término de este tiempo se adicionaran 250mL de fenol neutro a cada tubo con las mico bacterias lisadas, serán agitadas por vortex durante 30 minutos, y se centrifugararan a 14,000rpm por 5 minutos.

4. La fase acuosa se separó y se incorporó en otro tubo limpio, se le agregó 250mL de fenol-cloroformo 1:1, se agitó por vortex 30, y se centrifugó 5’ a 14,000rpm.

5. Posteriormente, las proteínas se precipitaran con dos volúmenes de cloroformo isoamílico 24:1, se agitó por vortex por 30 minutos y se centrifugó 5 minutos a 14,000 rpm.

6. Se pasara la fase acuosa a un tubo limpio y se precipitara el ADN con 0.1 volumen de acetato de sodio 3 M (pH 3.8) y dos volúmenes de etanol absoluto. Se incubara durante la noche a -20°C, y se centrifugara por 10 minutos a 13,000rpm. El ADN se lavara con dos volúmenes de etanol al 70% y se llevara a secar para su posterior utilización.

Reacción en cadena de la polimerasa

1.El ADN previamente purificado se resuspenderá en 50mL de agua, se tomara 5mL de este y se le agregaran 90mL de una mezcla de reacción que contiene 10mL del amortiguador comercial de Perkin-Elmer, MgCl2 a una concentración final de 2.5mM, 8mL de mezcla de dNTP.S a una

Concentración final de 125 mM, 3mL de iniciador directo (primer) 20mM, 3mL de iniciador inverso (primer) 20mM, 0.5mL de Taq AND polimerasa 5U/mL, llevándose a un volumen final de 100mL con agua libre de nucleasas.

2. El contenido del tubo se mezclara por vortex. La reacción se someterá a una temperatura de 94°C por 10 minutos y 25 ciclos bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 94°C por 10 minutos y 25 ciclos

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