TRABAJO PRÁCTICO N°2 PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO DE Escherichia Coli

TRABAJO PRÁCTICO N°2

PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO DE Escherichia Coli

-Corrección Trabajo Práctico N°2-

GRUPO N°5

LABORATORIO “K”

TURNO N°7 (TARDE)

ALUMNOS:     FUSARO, JACQUELINE

                         LORENZO, EZEQUIEL

                         TREZZA NEUMAYER, DELFINA

                         MUSSACHIO, DANTE ARIEL

FECHA DE ENTREGA: 

01 de junio de 2017

TRABAJO PRÁCTICO N°2

 Preparación de DNA plasmídico de Escherichia Coli

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas circulares extracromosómicas de DNA de doble cadena presentes en bacterias y en algunas células eucariotas. Al igual que el DNA cromosómico (circular y doble cadena con un tamaño aproximado de 4200 kpb), el DNA plasmídico posee una forma superenrollada y es de tamaño variable, sólo que es mucho más pequeño que el DNA cromosómico. En esta preparación, las bacterias contienen el plásmido pBluescript II SK/KS(-) de 2961pb de alto número de copias, esto significa que presentan de 20 a más de 200 copias del plásmido por célula. Éstos no son esenciales para la supervivencia de las bacterias, pero le confieren ventajas en condiciones de crecimiento determinadas. Tienen un origen de replicación y se duplican de modo independiente al DNA cromosómico, aunque que utilizan la maquinaria de la bacteria para llevarla a cabo.

Puede suceder que exista incompatibilidad plasmídica al coexistir dos plásmidos en una misma célula. Esta incompatibilidad se lleva a cabo cuando los plásmidos comparten parte de la maquinaria replicativa, lo que conlleva a compartir también parte del mecanismo de represión, es decir, aquel que regula la iniciación de la replicación.

OBJETIVO

Extracción de DNA plasmídico de alto número de copias (pBluescript II SK/KS) de Escherichia coli.

METODOLOGÍA

Se llevó a cabo un método denominado “método de lisis alcalina” utilizando una cepa bacteriana de Escherichia Coli con plásmido pBluescript de origen de replicación (ORI) de alto número de copias.
Se partió de un pellet de bacterias Escherichia Coli previamente  crecido en medio líquido rico en nutrientes.

Se utilizaron tres soluciones previamente preparadas por los docentes:

SOLUCIÓN 1 (SC1): “Solución de resuspensión”

Es una solución hipotónica, lo que significa que el agua tiende a ingresar a la bacteria, generando inestabilidad en la pared celular. Esto conlleva a la desestabilización de la célula, pero no a su rotura, debido a la presión que sufre.
Su función es resuspender las bacterias para que entren en contacto con la solución de lisis.

Contenido: Tris-HCl 50mM
                    EDTA 10 mM, pH 8
                    Mantenimiento en Hielo

SOLUCIÓN 2: “Solución de lisis alcalina”

Esta es la solución que efectivamente lisa las bacterias

 Contenido: SDS 1%
                    NaOH 200 mM

El SDS es un detergente iónico fuerte que rompe uniones no covalentes.
El NaOH al ser una base fuerte, aumenta el pH de forma abrupta.

SOLUCIÓN 3: “Solución de renaturalización”

Es una solución que permite renaturalizar el DNA plasmídico y que este se separe del DNA genómico.

Contenido: K+AcO- 3M, pH4.8

Esta solución neutraliza el pH básico de la solución de lisis.

PREPARACIÓN DE ADN PLASMÍDICO
-Método de lisis alcalina-

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DESARROLLO

Resuspensión de las bacterias para entrar en contacto con la lisis  

Se nos entregó en un tubo eppendorf el pellet correspondiente a 1.5 ml del cultivo bacteriano antes nombrado, resuspendido en 0.3 ml de la Solución 1. El tris-HCl es un buffer  que mantiene el pH constante en 8. El EDTA al ser un quelante de cationes divalentes,  desestabiliza la membrana plasmática de las bacterias provocando la repulsión de sus fosfatos (CÓMO SE LLAMABA ESTA CAPA?). Además, esto le permite inhibir las nucleasas que degradarían el DNA, al secuestrar sus cofactores. Con el mismo objetivo se mantienen las células en hielo ya que al bajar la temperatura, disminuye la actividad de estas enzimas.

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