Espectrofotometría: Espectros De Absorción Y Cuantificación Colorimétrica De Biomoléculas

8. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas

Nieves Abril Díaz1, J. Antonio Bárcena Ruiz1,

Emilio Fernández Reyes1, Aurora Galván Cejudo1,

Jesús Jorrín Novo1, José Peinado Peinado1,

Fermín Toribio Meléndez-Valdés1, Isaac Túnez Fiñana2

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,

1Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba, 2Facultad de Medicina, Avda. Menéndez Pidal s/n, 14004-Córdoba.

RESUMEN

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.

En esta práctica se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría. A continuación y tras la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro se harán espectros de absorción con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra presenta la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se cuantificarán las concentraciones de distintas biomoléculas.

Palabras clave: Absorbancia; transmitancia; colorimetría; cromóforo; espectro; rectas de calibrado.

Abreviaturas empleadas. A: Absorbancia; 4-AP: 4-Aminoantipirina; FMN: flavin mononucleótido; FMNH2: forma reducida del flavin mononucleótido; I: intensidad de luz; N-NEDA: N-Naftol-1-etilendiamino; p-NP: p-nitrofenol; POD: Peroxidasa; T: transmitancia; UV: luz ultravioleta.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo

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de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.

El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.

Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula -esto es, su espectro de absorción- constituye una seña de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético fundamental.

Figura 1. Diagrama de niveles de energía en una molécula. La absorción de energía luminosa hace que la molécula pase desde un estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la molécula relaja su energía mediante distintos mecanismos (vibración, rotación, etc.)

E

2

- E

1

= hν

En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm). Luz visibleLongitud de onda (metros)Rayos gamaRayos XultravioletainfrarrojomicroondasFrecuencia (hertz)energía (electrón-voltios)400 nm700 nmFigura 2. Espectro electromagnético

2

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal y el disolvente- que alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los espectros UV.

La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio.

En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite.

Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada.

La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.

longitud de onda color de luz que se color de luz que se aproximada absorbe refleja o ve

390 - 435 Violeta Amarillo verdoso

435 - 490 Azul Amarillo

490 - 580 Verde Rojo

580 - 595 Amarillo Azul

595 - 650 Naranja Azul verdoso

650 - 780 Rojo Verde azulado

1.1. Transmitancia y Absorbancia

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz o cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidió sobre ella, Io,

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