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l ADN es la sustancia química donde se almacenan las instrucciones que dirigen el desarrollo de un huevo hasta formar un organismo adulto, que mantienen su funcionamiento y que permite la herencia. Es una molécula de longitud gigantesca, que está formada por agregación de tres tipos de sustancias: azúcares, llamados desoxirribosas, el ácido fosfórico, y bases nitrogenadas de cuatro tipos, la adenina, la guanina, la timina y la citosina.

Los azúcares y los ácidos fosfóricos se unen lineal y alternativamente, formando dos largas cadenas que se enrollan en hélice. Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior de esta doble hélice y forman una estructura similar a los peldaños de una escalera. Se unen a las cadenas mediante un enlace con los azúcares. Cada peldaño está formado por la unión de dos bases, formando los pares de bases anteriormente mencionados; pero estos emparejamientos sólo pueden darse entre la adenina y la timina o entre la citosina y la guanina. Las secuencias -el orden en que se van poniendo- que forman adenina, timina, citosina y guanina a lo largo de la cadena de ADN es lo que determina las instrucciones biológicas que contiene.

datos básicos del ADN

1._ Unidades químicas básicas

un azúcar de 5 carbonos - desoxirribosa

fosfato - uniones entre los azúcares

bases: purinas = adenina y guanina

pirimidinas = timina y citosina

base + azúcar = nucleósido

base + azúcar

+ fosfato = nucleótido

2._Una hebra

Cada hebra esta hecha de un azúcar unido covalentemente a un fosfato que a su vez se une a otro azúcar y así sucesivamente. Cada hebra de ADN puede contener miles o millones de estas uniones azúcar-fosfato.

Cada azúcar tiene también, una purina o pirimidina unida a él covalentemente.

3._La doble hélice

Una molécula de ADN consiste en dos hebras que se encuentran arrolladas una alrededor de la otra formando una doble hélice. Las bases de las dos hebras se disponen en manera tal que cuando en una de ellas hay una adenina en la enfrentada hay timina y, cuando hay guanina en la otra hay citosina. Esto satisface la regla de Chargaff en manera tal que:

la cantidad de adenina = a la cantidad de timina (A = T)

la cantidad de guanina = a la cantidad de citosina (G = C)

4._Direccionalidad

La cadena de uniones azúcar-fosfato (la "columna vertebral", backbone en inglés) está construída en manera tal que posee una polaridad, esto es, que el fosfato en el carbono 5' de la desoxirribosa se une al 3' de la siguiente desoxirribosa. En este caso se dice que tiene una dirección 5' a 3'. Las dos hebras del ADN están dispuesta en manera tal que su disposición se conoce como antiparalela, donde una de ellas va de 5'- 3' y la complementaria de 3'- 5'.

ARN

La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los

plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.

Los inicios

Durante treinta años la mayor parte de la secuenciación de ADN se llevó a cabo con el método de terminación de la cadena desarrollado por Frederick Sanger y colaboradores en 1975.[1] [2] Antes del desarrollo de métodos rápidos de secuenciación del ADN a principios de los 70 por Sanger en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard,[3] [4] se utilizaban varios métodos de laboratorio. Por ejemplo, en 1973[5] Gilbert y Maxam publicaron una secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como "de punto corrido" (wandering spot).

La secuenciación del ARN, que por razones técnicas es más sencilla de llevar a cabo que la del ADN, se desarrolló con anterioridad a la del ADN. El mayor hito en la

secuenciación del ARN, que data de la era previa al ADN recombinante, es la secuencia del primer gen completo y del genoma completo del Bacteriófago MS2, identificado y publicado por Walter Fiers y colaboradores de la Universidad de Gante.[6] [7]

Secuenciación de Maxam-Gilbert

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y posterior escisión en bases específicas[8] Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciación química dos años antes del trascendental artículo de Sanger y Coulson sobre su método de secuenciación "más-menos",[9] [10] la secuenciación de Maxam y Gilbert rápidamente se hizo más popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el método inicial de Sanger requería que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del método de terminación de la cadena (ver más adelante), la secuenciación de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad técnica, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y dificultades para escalarla. Además, a diferencia del método de terminación de la cadena, los reactivos que se usan en el método de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizrse en un kit biológico estándar.

En resumen, el método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una

de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula. Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. Para visualizar

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