Una novela FMR1 método PCR para la detección rutinaria de baja abundancia Ampliado alelos y Full Las mutaciones en el Síndrome X Frágil

Una novela FMR1 método PCR para la detección rutinaria de baja abundancia Ampliado alelos y Full Las mutaciones en el Síndrome X Frágil

Abstracto

Antecedentes: el síndrome del cromosoma X frágil (FXS) es una enfermedad causada por la repetición de trinucleótidos la expansión de secuencias CGG en la región 5 'no traducida del FMR1 (1 retraso mental X frágil) de genes. Diagnósticos moleculares de FXS y otros emergentes FMR1 trastornos normalmente se basan en 2 pruebas, PCR y Southern Blot;sin embargo, el rendimiento o rendimiento limitaciones de estos métodos actualmente limitan las pruebas de rutina.

Métodos: Se evaluó una novela FMR1 tecnología PCR-gen específico con las plantillas de ADN de 20 líneas celulares y 146 muestras clínicas cegados. El número de repeticiones CGG se determinó por fragmento de dimensionamiento de amplicones de PCR con electroforesis capilar, y los resultados se compararon con los de FMR1 análisis de transferencia de Southern con las mismas muestras.

Resultados: El FMR1 PCR detectan con precisión alelos-mutación completa hasta al menos 1300 CGG repeticiones y que consiste en> 99% carácter GC. Todas las categorías de alelos detectados por transferencia de Southern, incluyendo 66 muestras con mutaciones completas, también se identificaron por el FMR1 PCR para cada una de las 146 muestras clínicas. Debido a que todos los alelos de mutación de pleno derecho en las muestras de mujeres heterocigotas fueron detectados por el PCR, cigosidad alelo se reconcilió en todos los casos. Los reactivos de PCR también detectó una fracción de 1% en masa de un alelo 940-CGG en un fondo de 99% 23-CGG alelo de un más o menos 5 veces mayor sensibilidad que la obtenida con la transferencia Southern.

Conclusiones: La nueva tecnología de la PCR puede clasificar con precisión el espectro deFMR1 alelos, incluyendo alelos previamente considerados demasiado grandes para amplificar; detectar reproducible baja abundancia alelos mutación completa; e inferir correctamente homocigosis en muestras de mujeres, lo que reduce considerablemente la necesidad de la muestra reflexing de transferencia de Southern.

El síndrome X frágil (FXS), 1 la forma más común de deterioro mental hereditario y la causa conocida genética del autismo, fue una de las primeras enfermedades humanas para vincularse a una expansión de repeticiones de nucleótidos triplete ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ).FXS es causado por la expansión de la secuencia de repetición CGG localizado en la región no traducida 5 'del FMR1 (retraso mental X frágil 1) gen ( 2 ). Los individuos con "normal" (<45 repeticiones CGG) o intermedio (45-54 repeticiones CGG) FMR1 alelos se cree actualmente para ser asintomáticos para los trastornos asociados con el FMR1 gen;Sin embargo, los individuos que son portadores de un alelo premutación (55 a 200 repeticiones CGG) pueden desarrollar el síndrome de temblor / ataxia X-frágil asociado ( 5) o insuficiencia ovárica primaria X-frágil asociado ( 6 ​​) ( 7 ) ( 8 ), mientras que los individuos con el FMR1 mutación completa (> 200 CGG repite) suelen tener FXS ( 9 ).Nada menos que 1,5 × 10 6 personas en los EE.UU. se cree que estar en riesgo de al menos un FMR1 trastorno ( 10 ). Por lo tanto, estas enfermedades son clínicamente importantes y afectan a una amplia gama de poblaciones y edades.

Actualmente, la mayoría de los paradigmas de diagnóstico de prueba para FMR1trastornos se basan en la PCR con la resolución tamaño por electroforesis capilar (CE), electroforesis en gel de agarosa (AGE), o PAGE para la resolución de tamaño para la detección de hasta 100-150 CGG repite. FMR1 Sur El análisis de transferencia se utiliza tanto para caracterizar muestras con los números de repeticiones CGG demasiado grande para amplificar por la PCR y para determinar el estado de metilación del gen de ( 11 ).Desafortunadamente, este flujo de trabajo es costoso, es el tiempo y mano de obra intensiva, y requiere grandes cantidades de ADN genómico (gDNA), lo que es inadecuado para los volúmenes de ensayo más altas o cribado de la población. La PCR tiene el potencial de abordar cada una de estas limitaciones, sin embargo, el carácter altamente rica en GC de la secuencia de repetición de triplete-X frágil históricamente ha sido refractaria a la amplificación. Tales innovaciones PCR como el uso de adyuvantes osmolíticas, nucleótidos modificados y ciclismo condiciones específicas han mejorado la detección de hasta aproximadamente 300 a 500 repeticiones CGG ( 12 ) ( 13 ), sin embargo, incluso esta actuación sería un fracaso para detectar muchos, si no la mayoría, completo alelos de mutación ( 14 ). Es importante destacar que el análisis de PCR de muestras de premutación y mutación completa hembras ha sido mucho menos éxito debido a la amplificación preferencial del alelo menor ( 12 ). En consecuencia, el> 20% de las muestras femeninas que son homocigotos debe reflexed a análisis de transferencia de Southern para resolver la ambigüedad potencial de un unamplified alelo más tiempo.

Se describe el funcionamiento de una novela de genes específicos de FMR1 tecnología PCR que puede resolver muchos de los desafíos tecnológicos que ahora limitan las pruebas de X frágil rutina. Este método reproducible amplifica alelos con repeticiones CGG> 1000 y demostró una excelente concordancia con transferencia de Southern en una evaluación de las muestras clínicas con FMR1 alelos que se extendió por toda la gama de CGG repite. La consistencia y la sensibilidad de los reactivos para detectar alelos premutación y mutación completa, incluyendo especies de mosaico que pueden estar presentes en sólo un pequeño porcentaje de las células, también resuelto ambigüedades en la identificación de muestras de hembras homocigóticas que pueden confundir convencionales FMR1 ensayos de PCR. Detección reproducible de los alelos mutación completa por parte de la PCR tiene implicaciones para la adopción más amplia de FMR1análisis.

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