Laboratorio de bioquimica - Cuantificación de Proteínas

Laboratorio N°6[pic 1]

Cuantificación de Proteínas

Objetivos de la práctica:

Comprender los conceptos de absorción de luz de una sustancia.

Familiarizarse con el manejo de un espectrofotómetro.

Realizar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

Determinar la concentración de proteínas plasmáticas mediante extrapolación en la curva de calibración obtenida.

Fundamento Teórico:

La determinación colorimétrica cuantitativa de una sustancia se basa en la capacidad de ésta para absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz incidente. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al espesor del medio  y  a  la  concentración  de  la  sustancia presente.  De  esta  manera,  si  se mantiene constante el espesor del medio, la absorción de luz por una sustancia disuelta en un medio transparente (Ej agua) será proporcional a su concentración molar.

Estos principios están contenidos en las leyes de Lambert – Beer y están expresadas en la siguiente ecuación: [pic 2]

donde A es la Absorbancia de la sustancia, e es el coeficiente de extinción molar, C es la concentración e l es el espesor de la solución, siendo éste último igual a 1 cm. El coeficiente e se expresa en litros/M cm y es numéricamente igual a la A de una solución 1M (1 Molar) de concentración.[pic 3]

Si  las  sustancias  siguen  la  ley  de  Lambert-Beer, presentan una relación lineal entre A y concentración. Por otro lado si la relación entre A y concentración es lineal para dos soluciones de la misma sustancia a igual espesor y longitud de onda, entonces se puede usar una de ellas de concentración conocida (estándar) para determinar la concentración de la otra solución. 

En la práctica para determinar espectrofotométricamente la concentración de una sustancia se requiere: a) una serie estándar de concentración conocida, en un rango de concentración que muestre absorción lineal y que permita expresar la concentración  en  A  por  unidad  de  masa  o  concentración.  b)  un  blanco  que contiene todos los componentes del ensayo con excepción de la sustancia a medir  y c) la muestra con la sustancia problema a una dilución tal que su lectura de A este en el rango lineal de la curva de calibración.

La determinación de proteínas totales se efectuará por el método Biuret: Cuando una solución de proteínas se alcaliniza y se le agrega una solución diluida de Sulfato de Cobre, el cobre bivalente Cu2+  reacciona con el enlace peptídico de las proteínas formando un complejo coloreado azul violeta que absorbe a 546 nm. Este compuesto corresponde a un complejo de coordinación formado entre el ion cúprico y dos enlaces peptídicos adyacentes.

La reacción de Biuret es propia de la sustancias que poseen, como mínimo, dos grupos:-CONH-, unidos directamente, o por medio de un átomo de Carbono o de Nitrógeno. Las proteínas y los péptidos (a partir de los tripéptidos), dan positiva esta reacción. La intensidad de este color se mide en el espectrofotómetro y es proporcional a la cantidad de proteínas presentes en el medio.

Experiencia Práctica

Se determinará la concentración total de proteínas plasmáticas de una muestra por el método de Biuret utilizando seroalbúmina de bovino (SAB, PM = 66.500) como estándar.

Materiales:

- 1 Espectrofotómetro                        - 7 Cubetas

- 7 Tubos ensayo de 10 mL                - 1 Pipeta graduada de  1 ml

- 1 Pipeta de 2 ml                        - 1 Pipeta de 1 ml

- 1 gradilla                                - Baño de agua  a 50°C

Reactivos:

- Reactivo de Biuret                        - Solución estándar de (SAB)  5 mg/mL en NaCl  0.9%p/v                     - Solución  NaCl  0.9 % p/v                - Muestra diluida 1: 20 v/v con NaCl 0.9 % p/v                        

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