LABORATORIO BIOQUIMICA

ACTIVIDADES A DESARROLLAR

Actividades relacionadas con métodos cualitativos para la identificación de aminoácidos y proteínas

Contenido del aporte:

I. Analice la siguiente situación:

Esta Usted dentro del desarrollo del laboratorio #1; su tutor de práctica le solicita que tome 500 ml de leche, fresca, de cantina, sin procesamiento térmico y le adicione con volúmenes controlados H2SO4 hasta un pH igual a 4.6. Luego de esto se centrifuga y se obtiene en el precipitado la proteína tipo caseína de la leche. El tutor les solicita que le explique el cambio químico que ha pasado para separar la caseína del sistema lácteo. De acuerdo a lo anterior, responda:

1. Efecto de la adición de protones (H +) del ácido sobre la estructura de la proteína:

Cuando se adiciona este ácido el estado fisiológico cambia, por el remplazo del hidrogeno por un radical positivo para formar sales.

El grupo carboxilo libre y el grupo amino libre en extremos opuestos en una cadena peptídica se llaman N-terminal y el C-terminal.

La mayoría de las cargas iónicas asociadas a una molécula proteínica son aportadas por las cadenas laterales de los aminoácidos, por tanto las propiedades iónicas de una proteína y su solubilidad depende de la composición de los aminoácidos; esto varía según los valores de pK de los grupos α-carboxilo de los aminoácidos libres que van de 1.8 a 2.5, (forma catiónica), y los valores de Pk de los grupos α-amino que va de 8.7 a 10.7,(forma aniónica).

Esto sucede porque los aminoácidos presentan 3 estados dependientes del pH

Ph ≤ pI: forma catiónica; PI: cero; Ph≥ pI: forma aniónica.

Adicionando H2SO4 la constante aumenta y el pK disminuye presentándose en forma catiónica.

2. ¿Por qué el pH tiene que llegar a 4.6?, ¿qué ocurre a pH 4,6 en relación con la solubilidad de una proteína?

Para que la caseína se encuentre en su forma de ion zwitterion, el grupo amino está protonado (-- NHз+), y el grupo carboxilo está ionizado (--COO -), así está en capacidad de recibir y donar electrones, dando a que esta carga es neutra.

Cuando el pH es (4.6), las caseínas de la leche está en su PI, hay una protonación de sus carboxilos libre, eliminando la carga negativa, lo que hace que desaparezca la estabilización y facilita la interacción de las caseínas, dando al final su precipitación.

En este pH 4.6 el estado de solubilidad es mínimo, permitiendo que esta se pueda precipitar para formar sales.

3. Exprese en una gráfica el comportamiento que tendrá la proteína a valores por encima y por debajo de 4.6, redacte el análisis de esta gráfica con sus propias palabras:

Punto isoeléctrico

A pH por debajo de 4.6 los pK de los grupos α-carboxilo se encuentra en forma protonada. Ph ≤ pI: forma catiónica, por tanto, las caseínas pierden su hidratación, aumentando el tamaño de las partículas, esto debido a la desestabilización, lo que da como resultado final su precipitación.

A pH por encima de 4.6 los valores de Pk de los grupos α-amino se encuentran en forma ionizada. Ph ≥ pI: forma aniónica; por tanto, las caseínas se encuentran hidratadas, disminuyendo el tamaño de las partículas, encontrando su estabilidad, esto sucede debido a las altas concentraciones de los ácidos glutámico y aspártico, donde se evita la tendencia a su agregación y la precipitación.

4. Realice un cuadro comparativo explicando las diferencias entre la hidrólisis química y enzimática de la caseína.

HIDRÓLISIS ACIDA HIDRÓLISIS ENZIMATICA

Los Lactobacillus o bacterias del ácido láctico, son “Gram positivas anaerobias” están presentes en el tracto gastrointestinal y son responsables de convertir la lactosa y otros monosacáridos en ácido láctico. La producción de ácido láctico baja el pH a ácido (4-5), lo cual hace a su vez que las caseínas precipiten además de inhibir el crecimiento de bacterias

Es efectuada por las enzimas proteasas, presente en el estómago de los mamíferos, como la renina y forma un precipitado denominado “paracaseína”.

II. Analice la siguiente situación:

Esta Usted dentro del desarrollo del laboratorio #1; su tutor de práctica le solicita que tome 500 ml de leche, fresca, de cantina, sin procesamiento térmico y le adicione con volúmenes controlados H2SO4 hasta un pH igual a 4.6. Luego de esto se centrifuga y se obtiene en el precipitado la proteína tipo caseína de la leche. Con esta proteína, Ud. procede a identificar mediante pruebas coloreadas, los siguientes aminoácidos: tirosina, metionina y cisteína, triptófano, aromáticos, histidina, arginina. El tutor les solicita que explique los resultados obtenidos. De acuerdo a lo anterior, complete el análisis de la siguiente tabla:

AMINOACIDO PRUEBA APLICADA RESULTADO ESTRUCTURA REACCION ENTRE AMINOACIDO Y REACTIVO

PRESENCIA AMINOACIDOS NINHIDRINA Aparición de color violáceo AMRILLO

Triptòfago HOPKINS-COLE Color violeta rojizo

TIROSINA XANTOPROTEICA Color amarillo, se vuelve anaranjado en medio fuerte alcalino. Se produce la nitración del anillo bencénico, presente en los aminoácidos aromáticos

ARGENINA SAKAGUCHI Debido a la presencia de un grupo guanino el cual reacciona con la solución α – naftol en presencia de bromo(componente del reactivo Sakaguchi), como resultado da coloración roja

HISTIDINA REACCION DE EHRLICH La histidina contiene un anillo aromático y un anillo nitrogenado respectivamente como radical, estos al reaccionar con al acido sulfanilico y el nitrito de sodio forman sales diazonio

BIURET DETECTA ENLACES PEPTÌDOS CORTOS Esta prueba es general para poliptìdos y proteínas esta reconoce las uniones peptìdicas y lo hace mediante la reacción que se da cuando se forma un complejo entre los iones Cu2+(característico de uno de los componentes del rea, ctivoCuSO4) y los pares no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces

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