Hormona De Crecimiento Humana: Generación De DNA Complementario Y Expresión En Bacterias

Hormona de Crecimiento Humana: Generación de DNA complementario y Expresión en Bacterias

La secuencia de nucleótidos de un ADN complementario al ARN mensajero de la hormona del crecimiento humana se clonó; que contiene 29 nucleótidos en su región 5 ' no traducida, los 651 nucleótidos que codifican para la prehormona, y toda la región 3' no traducida (108 nucleótidos). Los datos reportados predicen la secuencia previamente desconocida del péptido señal de la hormona de crecimiento humana y por comparación con las secuencias previamente determinadas de la hormona de crecimiento de rata y somatomamotropina coriónica humana , refuerza la hipótesis de que estos genes han evolucionado por duplicación de genes a partir de una secuencia ancestral común. Las secuencias de genes de la hormona de crecimiento humana se han relacionado en la fase a un fragmento del gen trp D de Escherichia coli en un vehículo de plásmido, y una proteína de fusión se sintetiza a nivel alto (aproximadamente el 3 por ciento de proteína bacteriana) bajo el control del regulador región del operón trp. Esta proteína de fusión (70 por ciento de cuyos aminoácidos son codificados por el gen de la hormona de crecimiento humana) reacciona específicamente con anticuerpos frente a la hormona de crecimiento humana y es estable en E. coli.

La hormona del crecimiento, junto con al menos otras dos hormonas polipeptídicas, coriónica somatomamotropina (placenta lactógeno ) y la prolactina , forma un conjunto de proteínas con homología de secuencia aminoacídica y en cierta medida de solapamiento actividades biológicas . ya que los genes de este conjunto de proteínas probablemente tienen un origen ancestral común, que constituye un excelente modelo para estudiar la evolución, estructura y regulación diferencial de genes relacionados. Además, puesto que la hormona del crecimiento humana es de considerable importancia médica y su suministro es limitado, la síntesis de la hormona de crecimiento en bacterias puede proporcionar la fuente alternativo requerido de esta hormona crítica.

Hemos aislado y analizado previamente Los clones bacterianos que contienen copias de ADN complementario (ADNc) transcripciones de ARN mensajero ( ARNm) para estas hormonas . La secuencia completa de ARNm de la prehormona de crecimiento rata ha sido informado; Además, la secuencia de datos han sido presentados para los fragmentos de aproximadamente 550 bases complementarias a una parte de la codificación (residuos de aminoácidos 24 a 191) y 3 'no traducidas partes de somatomamotropina coriónica humana (HCS) y la hormona de crecimiento humana (hGH) del ARNm. Una secuencia parcial de prolactina de rata ha sido determinado por Gubbins et al. Estos datos de secuencias demostraron que, Considerando que los genes de la hormona de crecimiento de la rata y el hombre habían divergido sustancialmente, de tal manera que diferían más de los genes para las hormonas humanas funcionalmente distintos hCS y la hGH. Ahora el informe la síntesis, clonación, y análisis de la secuencia de ADNc que contiene toda la codificación y la mayoría de las partes de no codificantes de ARNm de hGH. también se describe la inserción de estas secuencias en un "plásmido de expresión" que contiene parte del operón triptófano (trp) de Escherichia coli cuya contrucción ha sido realizado por Hallewel y Emtage. Se describe el uso de este plásmido para promover la síntesis bacteriana inducible de altos niveles de una proteína híbrida, 70 por ciento de los que se compone de código de aminoácidos por el gen de la hGH.

La hormona de crecimiento de aislamiento de mRNA humano . RNA poliadenilado fue aislado de los tumores hipofisarios humanos extirpados mediante hipofisectomía transesfenoidal . Para obtener una indicación de la integridad y la abundancia relativa de ARNm de la hormona del crecimiento en cada muestra , las preparaciones de ARNm individuales fueron traducidas en el sistema libre de células de germen de trigo , y los productos se analizaron por electroforesis en geles de dodecil sulfato de sodio - poliacrilamida ( Fig. . 1 ) . Entre los productos de traducción de los cinco ARN de acromegálico del tumor (Fig. 1 , los carriles 1 a 5) , la banda más prominente corresponde a una proteína de aproximadamente 24.000 daltons . Esta proteína se supone que es la hormona pregrowth humana , ya que es similar en tamaño a la rata de pre hormona de crecimiento ' ( fig. 1 , " rata " ) y se precipita por antisuero a hGH (datos no sembrada) . Esta suposición se justifica aún más en comparación con los productos de la traducción de ARN poliadenilado aislado de pituitaria bovina (fig. 1, " vaca ") y de un tumor productores de prolactina humana (Fig. 1 , carril 6 ) . Ambos de estos de ARN dirigida la síntesis de una proteína similar en tamaño a la hormona de crecimiento pre - humano y de rata , pero también dirigió la síntesis de una cantidad mayor de una proteína de mayor peso molecular , presumiblemente preprolactin. Los tumores muestran una variación en el grado en que la hGH ARNm está presente, tal como se mide por sus actividades de traducción. Sin embargo, la hGH ARNm parece ser la especie de ARNm más abundantes en los tumores acromegálicos (Fig. 1, los carriles 1 a 5). Estos resultados son consistentes con y verificar los diagnósticos clínicos realizados antes de la cirugía.

Tabla 1. Amino ácido nucleico y la secuencia homologa de ácido de la hormona del crecimiento, somatomamotropina coriónica, y sus mARN. Los datos para la hormona del crecimiento de rata (rGH) y somatomamotropina chononic humana (HCS) y sus mARN son a partir de (3 4). Para HCS, sólo los datos para los residuos de aminoácidos 24 a 191 (y la parte correspondiente del mARN) y una porción de la región 3' no codificante correspondiente al fragmento de 550 pb clonado se utilizan para las comparaciones, ya que los datos para las otras porciones no son disponible. La secuencia de aminoácidos de la porción de prepéptido de hCS se determinó por Sherwood et al.

* La homología en esta región se puede aumentar a 55 por ciento mediante la adición de brechas en las secuencias apropiadas. Este procedimiento también revela que hay una homología de 27 de 30 bases en la región de la AAUAAA (28). Conservación similares entre especies, pero con diferentes secuencias se encuentran cuando humana y de conejo 3-globina (29) y la insulina humana y de rata (30) se comparan.

La clonación molecular de ADNc de la hGH. El ARN poliadenilado a partir de los tumores que parecían tener la mayor abundancia de ARNm de hGH por el ensayo de traslación se agruparon para la síntesis de ADNc de doble cadena (fig. 2). Las porciones de los ADNc de doble cadena se analizaron por digestión con endonucleasas de restricción

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