Microscopio

1. Introducción

Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.

El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información.

La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la

intensidad de la coloración.

Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 um dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución.

Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.

2. Tipos de microscopios

Microscopio de campo claro – Es descendiente de los disponibles a partir de 1800.

Compuestos por:

Fuente luminosa que ilumina la muestra

Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra

Platina sobre la cual se coloca la muestra

Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra

Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo

La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este tipo de microscopio se deben utilizar métodos de tinción porque el campo claro de este no produce un nivel útil de contraste.

Microscopio de contraste de fase – Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial.

Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.

El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo llegan hasta la retina del ojo y las hacen visibles.

La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado.

Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.

Microscopio de fluorescencia – Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas autofluorecentes su aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración inmunocitoquímica. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Estos métodos sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en neurobiología y en detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos mineralizados.

Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir luz monocromática o casi monocromática, o entre el espécimen y el objetivo permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta el ojo o incida en una emulación fotográfica u otro procedimiento analítico.

Microscopio de barrido confocal – Se usa para estudiar la estructura de los materiales biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen.

Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.

Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolución de 0,1 um. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la

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