Articulo de genética, extracción de ADN

ANTECEDENTES:

Diferentes métodos disponibles para la extracción de ADN genómico humano sufren de uno o más inconvenientes incluyendo bajo rendimiento, calidad comprometida, costo, tiempo consumo, uso de solventes orgánicos tóxicos, y muchos más. Aquí, intentamos desarrollar un método para extraer ADN de 500 μL de sangre humana fresca o congelada.

METODOS
Se tomaron quinientos microlitros de muestras de sangre humana fresca y congelada utilizado para la estandarización del procedimiento de extracción. Se obtuvieron absorbancias a 260 y 280 nm, respectivamente, se estimó la relación (A260 / A280) para verificar la calidad y cantidad de la muestra de ADN. La evaluación cualitativa del ADN extraído fue verificada por Reacción en cadena de la polimerasa y doble digestión de la muestra de ADN.

RESULTADOS
Nuestro protocolo dio como resultado un rendimiento promedio de 22 ± 2.97 μg y 20.5 ± 3.97 μg de 500 μL de sangre fresca y congelada, respectivamente, que fueron comparables a muchas referencias de protocolos y kits.

CONCLUSIONES

Además de producir una gran cantidad de ADN, nuestro protocolo es rápido, económico y evita solventes orgánicos tóxicos como el fenol. Debido a que la calidad no se ve afectada, el ADN es adecuado para aplicaciones posteriores. El protocolo también puede ser útil para realizar Investigaciones moleculares básicas en laboratorios con fondos limitados.

PALABRAS CLAVE
Rentable, extracción de ADN, alto rendimiento, sangre humana

INTRODUCCIÓN

La creciente demanda de análisis basados ​​en el genoma en la evolución moderna y las investigaciones de enfermedades también han aumentado la necesidad de una cantidad masiva de ADN genómico puro que también debería estar libre de contaminantes de como proteínas y ARN. De hecho, es el requisito principal de diversas técnicas de biología molecular, como la Reacción cadena de polimerasa (PCR), análisis de enzimas de restricción, detección de mutaciones, genotipado, y el análisis de ligamiento, así como la determinación de anormalidades genéticas, estudios epigenéticos y varias pruebas diagnósticas y preventivas. Además, se convertiría en mucha más investigación amigable si el método de extracción de ADN se vuelve rápido, de bajo costo y eficaz.

El ADN se puede extraer de muchas muestras biológicas, como el cabello, sangre, semen, saliva, células de la piel y muchos más.  Entre estos, uno de los que han ganado una importancia asombrosa en las investigaciones biológicas es la sangre. La sangre se ha convertido en una parte integral de la bioquímica, la hematología y estudios clínicos e investigaciones forenses. Sirve como una importante fuente de ADN genómico debido a la presencia de ADN nucleado en las células blancas de la sangre.

Se han publicado muchos protocolos relacionados con el aislamiento del ADN de sangre.
Algunos de estos protocolos publicados aplicaron enzimas y disolventes orgánicos para producir ADN de alta calidad, sin PCR inhibidores, mientras que otros incluyen el procedimiento de salazón dirigido hacia mayores rendimientos de ADN. Por lo tanto, algunos protocolos son caros y consumen mucho tiempo, mientras que otros comprometen la calidad del DNA.

Lo tanto el presente trabajo tiene como objetivo desarrollar un protocolo libre de costosas enzimas y tóxicos disolventes orgánicos para extraer ADN puro  a partir de muestras de sangre de humano fresca y congelada

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MATERIALES Y MÉTODOS

• Muestras de sangre

Se tomaron muestras de sangre en tubos vacutainer  que contenían EDTA , de 20 individuos sanos elegidos al azar de las localidades y alrededor del campus de la Universidad de North Bengal, Siliguri, West Bengal, India. A los voluntarios se les otorgo su consentimiento informado para que se convirtieran en parte de este estudio. Todos los donantes fueron entrevistados y cuestionario sobre sus condiciones de salud, se completó con la asistencia del personal médico para garantizar que ninguno de los voluntarios tuviera alguna enfermedad prevalente. La investigación fue aprobada por el Comité de Ética Humana del Departamento de Zoología, de la Universidad de North Bengal, India y se realizó de acuerdo con el con la Declaración de Helsinki de 1975. Se utilizaron muestras de sangre fresca para la extracción de ADN después de 1 hora desde el momento de la recolección y para la muestra de sangre congelada, la extracción se hizo en general después del 15-21 días a partir de la fecha de recolección. En el caso de las muestras congeladas sangre, las muestras se refrigeraron a -20 ° C para su uso en el futuro. La sangre veces puede actuar como un posible riesgo biológico y, por lo tanto, se realizó un cuidado adecuado durante el manejo y toma de las muestras de sangre.

• Reactivos y soluciones

RBC lysis Buffer (RLB): 0.155 mol/L NH4Cl, 10 mmol/L KHCO3 and

0.1 mol/L EDTA (Na2) in 1000 mL of distilled H2O. The pH was adjusted

to 7.6.

Extraction Buffer: 1.5 mol/L Tris pH 7.6, 0.4 mol/L disodium salt

of ethylenediaminetetra acetic acid (Na2EDTA; Merck, Darmstadt,

Germany), 2.5 mol/L NaCl, 2% Cetyl trimethyl ammonium bromide

(CTAB; Merck, Germany) 850 mL H2O. Adjust the pH to 8.0 and make

the final volume to 1 L.

10% SDS (Sodium dodecyl sulfate).

β-Mercaptoethanol.

Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1).

Isopropanol.

70% and 90% ethanol (Merck, Germany);

• Procedimiento de extracción de DNA

El procedimiento de extracción se estandarizó tanto en fresco como en congelado de muestras de sangre.

Paso 1. Se transfirieron 500 μL de muestra de sangre del vacutainer a un tubo Eppendorf. En el caso de sangre congelada, la muestra se descongeló a temperatura ambiente durante 20-30 minutos antes de transferir la sangre al tubo eppendorf.

Paso 2. El plasma se aspiró cuidadosamente centrifugando la muestra a 2664 RCF durante 7 minutos a 4 ° C.

Paso 3. Se añadió 1 ml de RLB al precipitado, se mezcló suavemente y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1-2 minutos.

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