Como Identificar y conocer los conceptos de homogeneización, filtración y centrifugación

 OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

1. Identificar y conocer los conceptos de homogeneización, filtración y centrifugación.

2. Identificación, caracterización y análisis de pureza de las fracciones celulares obtenidas a partir del hígado de pollo.

3. Observación y distinción de las muestras en los tipos de microscopía de campo claro y fluorescencia.

4. Obtención de preparados enriquecidos en fracciones subcelulares por medio de las técnicas.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

 MATERIALES:

1. MATERIALES DEL LABORATORIO

a) 1 mortero

b) 1 gasa

c) 1 tubos ependorf de 1,5mL

d) 1 beaker de 100 ml

e) 100 ml de Verde de Janus

f) 1 beaker de 50 ml

g) 100 ml de buffer Tris 10 mM pH 7,5

h) 100 µl de colorante Hoechst 33258

i) 100 µl de Mytotracker

j) 1 caja de láminas y laminillas

k) Microscopio

l) Centrifuga

m) Micropipeta

n) Palillo de anticucho

MORTERO

GASA

TUBO EPENDORF DE 1,5ML

BEAKER DE 100 ML

VERDE DE JANUS

BEAKER DE 50 ML

BUFFER TRIS 10 MM

COLORANTE HOECHST 33258

CAJA DE LÁMINAS Y LAMINILLAS

CENTRIFUGA

MICROPIPETA

MICROSCOPIO

2. MATERIALES DEL ESTUDIANTE

a) 10 gr. de hígado de pollo por todo el laboratorio

HÍGADO DE POLLO

 MÉTODOS USADOS

PROCEDIMIENTOS

1. Colocar el hígado en el mortero para luego proceder a molerlo y extraer los ligamentos con un palillo de anticucho.

2. Tratar de lograr una pasta uniforme del hígado y añadir después 20 ml de la solución Tris 10 mM pH 7,5.

3. Tomar una gasa y posarla encima de orificio del beaker limpio para la filtración.

4. Transvasar 250 µl del extracto a 2 tubos eppendorf y agregue 500 µl de la solución de buffer Tris 10 mM pH 7,5.

5. Coger un rotulador y poner la palabra núcleo en la muestra para evitar confusiones.

6. Centrifuguar a 3000 rpm alrededor de 5 minutos. (El pellet que ha quedado se denomina fracción nuclear y resuspender en 200 µl de Tris 10 mM pH 7,5).

7. Colocar el sobrenadante del proceso anterior al 2 ependorf nuevos.

8. Coger nuevamente el rotulador, pero esta vez marcarlo con la palabra mitocondrias.

9. Centrifugar a 10000 rpm durante 8 minutos. (El pellet que ha quedado se denomina fracción mitocondrial, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 µl de buffer Tris 10 mM pH 7,5).

OBSERVAR LA FRACCIÓN NUCLEAR Y MITOCONDRIAL:

• Fracción nuclear

CAMPO CLARO:

1. Tomar los 10 µl del resuspendido del tubo marcado como núcleo.

2. Colocarlo en una lámina porta objeto.

3. Adicionar una gota de Azul de metileno.

4. Cubrir con una lámina cubreobjeto.

5. Observar a través del microscopio de campo claro.

6. Esquematizar.

FLUORESCENCIA

1. Coger otra lamina.

2. Adicionar 10 µl del colorante Hoechst 33258.

3. Cubrir con una lámina cubreobjeto.

4. Dejar reposar por 2 minutos.

5. Observe a través microscopio de fluorescencia.

6. Esquematizar.

• Fracción mitocondrias

1. Tomar el tubo marcado como mitocondrias

2. Adicionar 5 µl del resuspendido y 5 µl del colorante mytotracker a un ependorf

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