Cuantificación De Vitamina A Y Vitamina E

1.1. ANALISIS DE VITAMINAS A Y VITAMINA E

Reactivos

Diclorometano grado HPLC

Acetonitrilo grado HPLC

Metanol grado HPLC

Pentano para análisis

Estándares

Estándar Vitamina A (palmitato de retinol) o estándar de trabajo (materia prima de fabricación caracterizada frente a un estándar primario).

Estándar Vitamina E (acetato de tocoferol) o estándar de trabajo (materia prima de fabricación caracterizada frente a un estándar primario).

Preparación de Fase móvil

Fase móvil A: medir en una probeta por separado 520 mL de metanol grado HPLC y 380 mL de acetonitrilo grado HPLC. Mezclar y filtrar a través de filtros de membrana de 0,45 µm.

Fase móvil B: Diclorometano HPLC filtrado.

Condiciones Cromatográficas

Columna: LiChroCART® 125-4 mm Lichrospher 100 RP 18 5µm, o similar

Flujo: 1,4 mL/min

Volumen de inyección: 20 µl

Fase móvil A =Solución Fase móvil A

Fase móvil B = Diclorometano grado HPLC

Tiempos de Retención: Vitamina E Acetato 2,5 – 4,0 min

Vitamina A palmitato 4,5 – 7,0 min

Isocrático: 90 % Fase móvil A: 10% Fase móvil B

Longitudes de onda:

Vitamina E λ=284 nm

Vitamina A λ=326 nm

Tiempo (min) λ (nm)

0.00 284

4.00 326

12.00 fin

Preparación de la Solución Estándar

Solución Estándar: Pesar 63 mg, exactamente pesados, de estándar de vitamina E (acetato de tocoferol) y una cantidad equivalente a 8000 UI, exactamente pesados, de Vitamina A (palmitato de retinol) 1,0 mill. UI/g, en un matraz de 100 mL. Añadir 20.0 mL de Pentano y 20,0 mL de Diclorometano. Disolver y enrasar el matraz con acetonitrilo.

El peso de vitamina A a pesar se puede determinar con la siguiente fórmula:

Ej. : Para un estándar de concentración 1000 UI/mg se pesan aprox. 8,00 mg de vitamina A, exactamente pesados, a un matraz de 100 mL. Añadir 20 mL de Pentano y 20 mL de Diclorometano. Disolver y enrasar el matraz con acetonitrilo.

Filtrar las disoluciones a través de filtros de membrana de 0,45 µm e inyectar.

Preparar el estándar por duplicado.

Preparación de las Muestras

Preparar la muestra a una concentración equivalente al estandar. Añadir 10,0 mL de Pentano PA, agitar y añadir 10,0 mL más de Diclorometano grado HPLC. Agitar hasta su completa disolución y colocar en un baño de ultrasonidos durante al menos 45 minutos.

Añadir 10,0 mL de Acetonitrilo para HPLC, agitar y ultrasonicar durante 20 minutos más.

Después de alcanzar la temperatura ambiente, completar el volumen del matraz con Acetonitrilo. Homogeneizar y filtrar a través de membrana de 0,45 µm.

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