ANEXO 1 COLECCIÓN DE MUESTRAS DE HECES

ANEXO 1

COLECCIÓN DE MUESTRAS DE HECES

 HISOPADO RECTAL

• Realizar asepsia del área anal con un rociador conteniendo solo agua estéril  y secar el área rociada con gasas.
• Tomar la muestra introduciendo la punta de un hisopo de algodón humedecido con solución salina o medio de transporte en el recto, rotarlo suavemente y retirar.

 La muestra estará bien tomada si observamos un ligero color café en el hisopo y se enviará  inmediatamente al laboratorio en medio de transporte.

 DIRECTAMENTE DEL RECTO

• Introducir los dedos protegidos con un guante de palpitación nuevo por el recto. Nos podemos ayudar sujetando al animal por la cola y mojando los dedos con agua estéril o con un poco de vaselina.  Se recomienda realizar asepsia previa de la zona con agua estéril  para evitar la contaminación bacteriana.
• Con dos dedos, estimular la defecación del animal (utilizaremos solo un dedo si el animal es muy pequeño), sólo hay que girar los dedos en forma circular para la estimulación.
• Colectar aproximadamente 5cc de materia fecal,  invertir el guante de palpación y anudarlo para ser transportado de inmediato al laboratorio.

ANEXO 2

TINCIÓN DE GRAM

• Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar.
• Añadir cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto.
• Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con agua de la llave permitiendo que ésta fluya a través del frotis.
• Agregar solución de yodo lugol a la preparación y dejar actuar 1 minuto, transcurrido el tiempo, lavar el frotis con agua de la llave.
• Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona cubriendo la preparación durante 10 a 15 segundos, lavar el frotis con agua de la llave.
• Añadir el colorante de contraste safranina, dejar actuar durante 30 segundos o 1 minuto, lavar el frotis con agua de la llave.
• Secar suavemente la preparación y observar en el microscopio óptico de campo claro, utilizando los objetivos de 10x y de 100x.

INTERPRETACIÓN

Las bacterias Gram + se tiñen de  color morado y las Gram – de color rosa.

ANEXO 3

TÉCNICA DE ESTRIADO PARA CULTIVO PURO O POR AGOTAMIENTO

• Tomar una porción de la muestra con hisopo o con el asa de nicromio circular.
• Depositar en un extremo de la placa y con el asa de nicromio circular estéril, realizar estrías confluentes en el primer cuadrante de la caja Petri que contiene el agar.
• Rotar la caja alrededor de 90° y estriar el segundo cuadrante del agar.
• Rotar la caja otros 90° y estriar el tercer cuadrante del agar.
• Una vez más rotar la caja 90° para estriar el cuarto cuadrante del agar terminando en el centro del mismo.
• Incubar la caja de Petri en posición invertida.

[pic 1]

ANEXO 4

SISTEMA MINIATURIZADO API 20E

PREPARACIÓN DEL INÓCULO

Con un asa de nicromio estéril se toma una colonia del medio de cultivo seleccionado,  colocar en la pared del tubo de ensaye que contiene solución salina al 0,85% estéril, desintegrar la colonia con el asa, homogeinizar la solución y  agregar colonias hasta igualar la turbidez de la suspensión con la del  tubo 0,5 del Nefelómetro de McFarland.

INOCULACIÓN DE LA GALERÍA API 20 E

1. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con ayude de una pipeta Pasteur estéril.

• En las pruebas [CIT], [VP] y [GEL] llenar el tubo y la cúpula.
• En el resto de las pruebas,  únicamente llenar los tubos y no las cúpulas.
• Para las pruebas ADH, LDC, ODC, H2S, URE crear una atmósfera anaerobia llenando la cúpula con aceite mineral

1. Colocar agua destilada a la cámara de incubación hasta llenar todos los pocillos y dejar un excedente de aproximadamente 3 mL.
2. Colocar la tapa a la cámara de incubación.
3. Incubar a 35°C ± 2°C durante 18-24 horas en aerobiosis.

INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS

• Prueba Triptófano desaminasa (TDA);  agregar una gota de cloruro férrico al 10%.
• Prueba indol: añadir una gota del reactivo de Kovac´s.
• Prueba Vogues Proskauer; agregar una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (α- Naftol).
• Complementar con la prueba oxidasa; colocar en un portaobjetos, un trozo de papel de filtro de aproximadamente 1x1cm, agregar la colonia con la ayuda de un aplicador de madera y añadir 1  gota del reactivo de oxidasa (Clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina) y dejar actuar durante 30 segundos, la prueba es positiva cuando la colonia presenta una coloración azul oscuro o morada.

DETERMINACIÓN DEL PERFIL NUMÉRICO:

• En la hoja de resultados, los test están separados en grupos de tres y se indica para cada uno un valor de 1, 2 ó 4. Como la galería API 20E comprende 20 ensayos, sumando al interior de cada grupo los valores que corresponden a reacciones positivas, se obtiene un perfil numérico de 7 cifras (a la reacción de la oxidasa, que constituye el test No. 21 se le asigna un valor de 4, cuando resulte positiva).

IDENTIFICACIÓN

• Se realiza a partir de una base de datos  con la ayuda del software de identificación apiweb TM:
• Introducir manualmente, mediante el teclado, el perfil numérico de 7 cifras.
• Obtener el género y la especie de la bacteria identificada.

TABLA DE LECTURA

ANEXO 5

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

MÉTODO DE KIRBY BAUER

1. Seleccionar las colonias:

• Utilizar un asa de nicromio circular estéril para tomar de la placa sólo colonias bien aisladas.

2. Preparar una suspensión  bacteriana utilizando solución salina al 0,85% estéril.

3. Estandarizar la suspensión del inóculo:

...