Actividad Enzimática De La -Amilasa

Trabajo práctico Nº 6.

Actividad enzimática de la -Amilasa

Introducción

Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran la velocidad de las reacciones químicas. En las reacciones, las enzimas actúan sobre moléculas (sustratos), las cuales pasan a ser moléculas distintas denominados productos.

La actividad de estas reacciones enzimáticas puede demostrarse con la velocidad en la que aumenta la cantidad de producto o la velocidad con la que desaparece el sustrato. Para esto existen varias técnicas:

*Espectrofotometría: siguiendo una reacción y midiendo la cantidad de sustrato que desaparece o producto que aparece.

*Sustratos marcados radiactivamente,

*Test colorimétrico: coloreando al sustrato y midiendo el color en distintos momentos durante el avance de la reacción, que indique que cantidad de sustrato se degrada en determinado tiempo.

Cuando estudiamos la actividad de una enzima, determinamos, para poder caracterizarla cuales son las condiciones óptimas (pH, temperatura, etc) donde ésta trabaja a su mayor capacidad.

En el trabajo práctico estudiaremos la enzima - Amilasa, es aquella enzima encargada de degradar el almidón (sustrato). Utilizamos esta enzima ya que es de fácil obtención así como también es fácil de medir su reacción enzimática.

Para medir la actividad enzimática de la - Amilasa, utilizaremos la técnica del test colorimétrico, que permite revelar la presencia de almidón en la solución, siguiendo la reacción a lo largo del tiempo hasta la desaparición del color o efecto acromático, que corresponde a la desaparición del sustrato que se ha convertido en producto.

Para darle color a la solución usamos I3, este se intercala en el polímero de glucosa, y le brinda un color azul que no se traslada a los productos, en este caso Amilosa y Amilopectina.

Para aumentar la solubilidad del Iodo utilizamos una solución de Lugol (solución de 1% de I2 en equilibrio con KI 2% en agua destilada.

Objetivos

Estudiar la enzima - Amilasa salival y caracterizarla modificando las condiciones óptimas en la que actúa.

Materiales

. Saliva (contiene - Amilasa)

. Vaso de precipitados.

. Tubos de ensayo.

. Agua destilada.

. Tapones de goma.

. Almidón

. Agua común.

. Lugol (1% de Iodo diatómico en equilibrio con ioduro de potasio (KI) 2%, en agua destilada)

. Baño termostatito.

. Gradilla.

. Cubeta con hielo.

. Pipetas.

. Erlenmeyer.

Reacción en estudio

Amilosa

Almidón Amilosa + Amilopectina.

Diseño experimental

Recolectamos 2-3 mL de saliva de un integrante del grupo en un vaso de precipitados y medimos su pH.

Luego hicimos una dilución de 1:5 con H2O destilada. También se nos entregó un tubo con 10 mL de la solución de almidón 1% m/V con pH neutro a 37º C, el cual se mantuvo durante todo el experimento a esta temperatura.

En un erlenmeyer preparamos una solución con 200 mL de H2O y 250 L de Lugol. De esta solución preparada colocamos 5 mL en varios tubos rotulados de acuerdo al tiempo durante la reacción en la que se la utilizará.

El tubo 0 corresponde al tubo control, el cual contenía 100 L de la solución con almidón y 5 mL del Lugol, esta solución no está catalizada, y es de color azul.

Una vez preparados los tubos, procedimos a incorporar 1 mL de saliva diluida en el tubo con almidón y comenzamos a cronometrar en el inicio de la reacción.

A partir de este paso, cada 30 segundos tomamos 100 L de la solución de almidón y saliva.

Continuamos este paso hasta la aparición del efecto acromático. Repetimos el mismo experimento con dos variables de temperatura (0º C y 20º C) y uno con un pre tratamiento de la saliva diluida a 100º C.

Resultados

Grupo pH Dilución TR  Proteasa pH:12 0ºC 20ºC 70ºC NaCl

1 7 1:25 70” 210” No hay cambio

2 7,0-7,2 1:5 120” 240” No hay cambio 630” No hay cambio

3 6,7 1:30 480” 960” no hay cambio 150”

4 6,7 1:5 120” 390” no hay cambio 300” No hay cambio

240”

Tabla 1. Resultados obtenidos en los

...