Actividad enzimática, absorvancia INTRODUCCIÓN

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                   [pic 1]

Informe Laboratorio N°2

Actividad Enzimática

CURSO: BIOQUIMICA VEGETAL

30 de abril del 2018

INTRODUCCIÓN

Una enzima es una proteína que cataliza las reacciones bioquímicas del metabolismo. Las enzimas actúan sobre las moléculas conocidas como sustratos y permiten el desarrollo de los diversos procesos celulares.

Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser proteínas y actúan acelerando la reacción. Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las demás conformaciones posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad catalítica. Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima son pH y temperatura.
La α-amilasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces α-glucosídicos, de los polisacáridos α-glucosídicos de alto peso molecular, tales como el almidón y el glucógeno, liberando glucosa y maltosa.

En este práctico se debe emplear  una curva de calibración para determinar la concentración del complejo yodo-almidón, determinar la actividad enzimática de una solución de almidón y finalmente se debe medir el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

OBJETIVOS

• Construir una curva de calibración
• Reconocer cuando actúa una enzima.
• Reconocer el efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
• Reconocer el efecto del pH en la actividad enzimática.
• Determinar la actividad de las enzimas.

HIPOTESIS DE TRABAJO

La actividad enzimática se debe a su estructura proteica, por lo tanto cualquier modificación que perturbe esta estructura, ya sea cambio de pH o temperatura puede llevar a un cambio de actividad. Existen variaciones de temperatura que hacen  que la enzima se desnaturalice  y pierde características biológicas lo mismo ocurre al aplicar un pH el cual este fuera del rango optimo , provocando así que la actividad enzimática pierda su estructura considerablemente.

MATERIALES Y METODOS

• 1 gradilla para tubos de ensayo
• 15 tubos de ensayo (15 ml)
• Pinzas de madera
• Pipetas de vidrio (1 ml, 2 ml, 5 ml)
• 3 vasos de precipitado (50 o 100 ml)
• Baño de hielo (0 °C)
• Baño termorregulador a 37 °C
• Baño agua a 90 °C(Baño María)
• Cubetas para espectrometría
• Espectrofotómetro

Soluciones y reactivos:

• Solución de almidón al 0.5% (p/v)
• Solución de lugol
• Solución buffer fosfato de sodio 0,2 M (pH 7)
• Solución buffer (pH 4.8)
• Solución buffer (pH 6.5)
• Solución buffer (pH 7.5)
• Solución buffer (pH 9.0)
• Agua destilada
• Saliva humana

PROCEDIMIENTO

Construcción de la curva de calibración graficando concentración v/s Abs 590 nm.

De acuerdo a lo aprendido usar los cálculos para completar la tabla.

• Añada a cada tubo 500 ml de solución de Lugol y agite.
• Completar el volumen de cada tubo a 5.0 ml final con agua destilada. agite
• Determinar en el espectrofotómetro la absorbancia a 590 nm y construir la curva de calibración.

Experimento 1: Determinación de actividad enzimático

• Un integrante debe depositar en un tubo de ensayo 4 ml de saliva diluir en agua hasta obtener 20 ml de “solución enzimática”
• Con 2 tubos de ensayos, agregar a ambos solución de almidón de 0.5 % (p/v).
• Agregar al primer tubo 1 ml de buffer fosfato de sodio a 0.2 M (pH 7) y 0.5 ml de solución de salida diluida (solución enzimática). Al segundo tubo agréguele 1.5 nl de buffer fosfato sodio 0.2 M (p H 7). Mezclar.
• Incubar por 10 min en baño termorregulador a 37°C.
• Añadir 0.5 ml de solución de Lugol a cada tubo, ajustar el volumen a 5 ml utilizando agua destilada (2ml de agua)
• Realizar la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro de 590 nm y establecer la concentración de almidón presente en cada tubo.
• Determinar la concentración de almidón mediante a la curva de calibración.

Experimento 2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

• Disponer de cuatro tubos de ensayo, rotularlos. Agrega a cada uno de los tubos 1 ml de solución de almidón al 0.5% y 1 ml de buffer fosfato de sodio 0.2 M (p H 7).
• Se inicia la reacción enzimática agregando 0.5 ml de la solución de saliva diluida.
• Hundir nuevamente en sus temperaturas adecuadas.

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