Apuntes proteómica

Proteómica

Genoma: es todo el material genético contenido en las células de un organismo.

            Término acuñado en 1920 por H Winkler

Proyecto genoma: inicia en 1986, y se finaliza en el 2001

• 30, 000 genes
• 30 billones de pb
• alrededor del 2% codifica para la síntesis de proteínas
• humano 30m genes
• chimpancé 30m genes
• ratón 30m genes
• a. thaliana 25m genes
• c. elegance 19m genes
• d. melanogaster 13m genes

Se desconoce mas del 50% de los genes descubiertos

La proteómica es el estudio y caracterización de todo el conjunto de proteínas expresadas en un genoma.

            Termino acuñado por M. Wilkins en 1994

Las proteínas están involucradas en la mayoría de las funciones biológicas.

• 54% sirven de receptores celulares de membrana
• 24% son enzimas
• 14% hormonas y factores de crecimiento
• 9% canales iónicos
• 2% receptores nucleares
• 2% DNA

Química de proteínas

Proteómica

Análisis de proteínas

Proteínas individuales

Mezclas complejas

Análisis de secuencias completas

Análisis de secuencias parciales

Énfasis sobre estructura y función

Énfasis en la identificación por medio de base de datos

Biología estructural

Biología de sistemas

Incluye:

• Localización
• Modificaciones post-traduccionales
• Interacciones proteína-proteína
• Determinación de la estructura
• Finalmente conocer la función

El análisis de mRNA no siempre refleja la abundancia en el nivel de expresión de proteínas

Todas las proteínas eucarióticas sufren modificaciones post-traduccionales

La función de la proteína depende de su localización final

Algunas de las muestras biológicas no contienen ácidos nucleicos.

La proteómica se enfoca en estudiar los productos del gen, que son los agentes activos de células/ tejidos / órganos.

• Es indispensable para:
• Elucidar isoformas proteicas
• Modificaciones post-traduccionales
• Localización del producto del gen
• Interacciones proteína-proteína

Aplicaciones de la proteómica

• Identificación de nuevos marcadores par el diagnostico de enfermedades
• Identificación de nuevos fármacos
• Determinación de proteínas involucradas en la patogenia de enfermedades
• Transducción de señales

Ramas

De expresión

• Estudia cuanta proteína se tiene en un tejido especifico
• Involucra:

• Separación de mezclas proteicas complejas
• Identificación de los componentes individuales
• Análisis sistemático cuantitativo
• Útil para poder diferenciar entre tejidos sanos y enfermos; observar diferencias entre antes de un tratamiento y después del mismo para ver si funciona o no.

Estructural

• Caracterizar la estructura 3D de las proteínas para conocer los sitios activos y dominios funcionales.
• Relevancia medica

funcional

• localizar las proteínas e identificar las interacciones que se producen entre ellas y otras moléculas para determinar la función.

Retos

• No todas las tecnologías para la caracterización a gran escala de proteínas con útiles para cada aplicación.
• Es necesario integrar y estandarizar todas las técnicas
• Es importante el superar cada problema en cada una de las etapas del análisis:

• Preparación de la muestra
• Análisis de datos

Reporte de lectura

Importancia central de las proteínas

• Funciones biológicas
• Catalizadores biológicos
• Participan y sufren modificaciones postraduccionales
• Rol estructural y mecánico
• Transporte celular
• Replicación celular
• Regulación celular
• Mecanismos de defensa
• Adhesión celular

Directo al portafolio

 Análisis del proteoma

Caracterizar y cuantificar todas las proteínas de un tipo celular especifico bajo determinadas condiciones, incluyendo todas las modificaciones postraduccionales.

Identificación de proteínas

• La secuencia de péptidos de aproximadamente 6 aminoácidos son en gran medida únicos en el proteoma de un organismo.
• Un péptido de 6aa, mapea para el producto de un gen.

Esencia de la proteómica

• Obtener secuencia peptídica
• Obtener masa exacta
• Identificar la proteína mediante bases de datos

Porque lisar?

• Es necesario separa mezclas proteicas complejas u convertirlas en mezclas más sencillas
• La MS no puede medir el PM de proteínas intactas
• Los péptidos son analizados por dos tipos de MS:

• MALDI-TOF
• ESI (electro spray)

Separación proteica

Extracción de proteínas

Pasos:

• Muestra biológica

• Fluidos biológicos
• Tejidos
• Células
• Componentes subcelulares

• Dependiendo de qué tipo de proteína se quiera obtener, es el tipo de muestra a manejar.
• Separación de proteínas
• Detección de proteínas
• Identificación de proteínas
• Análisis funcional

Objetivo final en la preparación de la muestra

Recuperar tanta proteína como sea posible con la menor cantidad de contaminación posible (lípidos, celulosa, ácidos nucleicos).

Limitante principal de la proteómica es la falta de un método de amplificación, equivalente al PCR, para proteínas escasas.

La sensibilidad es un punto crítico del análisis.

Reactivos para extracción

• Detergentes (SDS, CHAPS, Tween) solubilizar proteínas de membrana y separar de los lípidos
• Agentes reductores: reduce puentes disulfuro
• Agentes desnaturalizantes: rompen interacciones proteína-proteína, estructura secundaria y terciaria al alterar la fuerza iónica y pH
• Enzimas: digerir contaminantes como DNA

Recomendaciones

• Menos tratamiento para evitar pérdidas
• Controlar la temperatura (frío) para evitar modificaciones
• Tiempo de preparación corto (ambas)

Requerimientos técnicos

• Alta resolución: fracciones simples, que idealmente resulte en “una fracción, una proteína”
• Alto rendimiento: que provea la mayor cantidad posible de proteína.
• Compatible con el análisis por MS

Técnicas de separación proteica

• Electroforesis bidimensional
• Cromatografía liquida multidimensional

• Exclusión
• Intercambio iónico
• Afinidad
• HPLC

Electroforesis Bidimensional

...