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Apuntes proteómica

IlderionApuntes3 de Diciembre de 2017

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Proteómica

Genoma: es todo el material genético contenido en las células de un organismo.

            Término acuñado en 1920 por H Winkler

Proyecto genoma: inicia en 1986, y se finaliza en el 2001

  • 30, 000 genes
  • 30 billones de pb
  • alrededor del 2% codifica para la síntesis de proteínas
  • humano 30m genes
  • chimpancé 30m genes
  • ratón 30m genes
  • a. thaliana 25m genes
  • c. elegance 19m genes
  • d. melanogaster 13m genes

Se desconoce mas del 50% de los genes descubiertos

La proteómica es el estudio y caracterización de todo el conjunto de proteínas expresadas en un genoma.

            Termino acuñado por M. Wilkins en 1994

Las proteínas están involucradas en la mayoría de las funciones biológicas.

  • 54% sirven de receptores celulares de membrana
  • 24% son enzimas
  • 14% hormonas y factores de crecimiento
  • 9% canales iónicos
  • 2% receptores nucleares
  • 2% DNA

Química de proteínas

Proteómica

Análisis de proteínas

Proteínas individuales

Mezclas complejas

Análisis de secuencias completas

Análisis de secuencias parciales

Énfasis sobre estructura y función

Énfasis en la identificación por medio de base de datos

Biología estructural

Biología de sistemas

Incluye:

  • Localización
  • Modificaciones post-traduccionales
  • Interacciones proteína-proteína
  • Determinación de la estructura
  • Finalmente conocer la función

El análisis de mRNA no siempre refleja la abundancia en el nivel de expresión de proteínas

Todas las proteínas eucarióticas sufren modificaciones post-traduccionales

La función de la proteína depende de su localización final

Algunas de las muestras biológicas no contienen ácidos nucleicos.

La proteómica se enfoca en estudiar los productos del gen, que son los agentes activos de células/ tejidos / órganos.

  • Es indispensable para:
  • Elucidar isoformas proteicas
  • Modificaciones post-traduccionales
  • Localización del producto del gen
  • Interacciones proteína-proteína

Aplicaciones de la proteómica

  • Identificación de nuevos marcadores par el diagnostico de enfermedades
  • Identificación de nuevos fármacos
  • Determinación de proteínas involucradas en la patogenia de enfermedades
  • Transducción de señales

Ramas

De expresión

  • Estudia cuanta proteína se tiene en un tejido especifico
  • Involucra:
  • Separación de mezclas proteicas complejas
  • Identificación de los componentes individuales
  • Análisis sistemático cuantitativo
  • Útil para poder diferenciar entre tejidos sanos y enfermos; observar diferencias entre antes de un tratamiento y después del mismo para ver si funciona o no.

Estructural

  • Caracterizar la estructura 3D de las proteínas para conocer los sitios activos y dominios funcionales.
  • Relevancia medica

funcional

  • localizar las proteínas e identificar las interacciones que se producen entre ellas y otras moléculas para determinar la función.

Retos

  • No todas las tecnologías para la caracterización a gran escala de proteínas con útiles para cada aplicación.
  • Es necesario integrar y estandarizar todas las técnicas
  • Es importante el superar cada problema en cada una de las etapas del análisis:
  • Preparación de la muestra
  • Análisis de datos

Reporte de lectura

Importancia central de las proteínas

  • Funciones biológicas
  • Catalizadores biológicos
  • Participan y sufren modificaciones postraduccionales
  • Rol estructural y mecánico
  • Transporte celular
  • Replicación celular
  • Regulación celular
  • Mecanismos de defensa
  • Adhesión celular

Directo al portafolio

 Análisis del proteoma

Caracterizar y cuantificar todas las proteínas de un tipo celular especifico bajo determinadas condiciones, incluyendo todas las modificaciones postraduccionales.

Identificación de proteínas

  • La secuencia de péptidos de aproximadamente 6 aminoácidos son en gran medida únicos en el proteoma de un organismo.
  • Un péptido de 6aa, mapea para el producto de un gen.

Esencia de la proteómica

  • Obtener secuencia peptídica
  • Obtener masa exacta
  • Identificar la proteína mediante bases de datos

Porque lisar?

  • Es necesario separa mezclas proteicas complejas u convertirlas en mezclas más sencillas
  • La MS no puede medir el PM de proteínas intactas
  • Los péptidos son analizados por dos tipos de MS:
  • MALDI-TOF
  • ESI (electro spray)

Separación proteica

Extracción de proteínas

Pasos:

  • Muestra biológica
  • Fluidos biológicos
  • Tejidos
  • Células
  • Componentes subcelulares
  • Dependiendo de qué tipo de proteína se quiera obtener, es el tipo de muestra a manejar.
  • Separación de proteínas
  • Detección de proteínas
  • Identificación de proteínas
  • Análisis funcional

 

Objetivo final en la preparación de la muestra

Recuperar tanta proteína como sea posible con la menor cantidad de contaminación posible (lípidos, celulosa, ácidos nucleicos).

Limitante principal de la proteómica es la falta de un método de amplificación, equivalente al PCR, para proteínas escasas.

La sensibilidad es un punto crítico del análisis.

Reactivos para extracción

  • Detergentes (SDS, CHAPS, Tween) solubilizar proteínas de membrana y separar de los lípidos
  • Agentes reductores: reduce puentes disulfuro
  • Agentes desnaturalizantes: rompen interacciones proteína-proteína, estructura secundaria y terciaria al alterar la fuerza iónica y pH
  • Enzimas: digerir contaminantes como DNA

Recomendaciones

  • Menos tratamiento para evitar pérdidas
  • Controlar la temperatura (frío) para evitar modificaciones
  • Tiempo de preparación corto (ambas)

Requerimientos técnicos

  • Alta resolución: fracciones simples, que idealmente resulte en “una fracción, una proteína”
  • Alto rendimiento: que provea la mayor cantidad posible de proteína.
  • Compatible con el análisis por MS

Técnicas de separación proteica

  • Electroforesis bidimensional
  • Cromatografía liquida multidimensional
  • Exclusión
  • Intercambio iónico
  • Afinidad
  • HPLC

 

 

 

Electroforesis Bidimensional

Generalidades

  • Técnica electroforética que permite la separación de una proteína basándose en su carga(IEF) y masa (SDS-PAGE)
  • Permite separar hasta miles de proteínas en un solo experimento
  • Su principal aplicación es en la proteómica de expresión

 Principios generales

  • Técnica:
  • Cualquier molécula cargada migrará al aplicársele un campo eléctrico
  • El grado de migración dependerá de la fuerza del campo eléctrico y de la densidad de carga de la molécula. Relación carga-masa.

 Importancia

  • La 2DGE puede revelar virtualmente TODAS las proteínas presentes en una célula o tejido incluyendo aquellas con modificaciones postraduccionales.
  • Una muestra contiene 100-300mg de proteína total genera 1000 – 2000 manchas (proteínas)
  • En condiciones particulares en laboratorios especializados, el número puede llegar hasta 10, 000.

 Ventajas

  • Alta resolución
  • Permite el empleo de varios métodos de tinción (lo que incrementa la sensibilidad)
  • Es sencillo elaborar el gel
  • Fácil extracción proteica del gel
  • Parámetros de separación ortogonales
  • Cada dimensión es capaz de resolver 100 – 200 proteínas. Combinadas 10,000 en geles de 20 x 20 cm.

Aspectos técnicos

  • Normalmente la 2DGE se aplica en el siguiente orden:
  • Realizar 1D: IEF
  • Cambio de buffer
  • Poner en contacto directo el gel 1D con el gel 2D (SDS-PAGE)
  • Detectar spots de las proteínas separadas
  • Realizar modificaciones necesarias para obtener la separación deseada.

Puntos críticos

  • Preparación de la muestra
  • Todas las proteínas solubilizadas de manera estable
  • Prevenir que haya interaccione proteínas-proteínas o interacciones hidrofóbicas
  • Eliminar cualquier contaminación con DNA o RNA
  • Prevenir oxidación, degradación proteolítica o alteración conformacional
  • Cantidad de proteína: puede variar de mg a 1g, dependerá del gel y del interés que se tenga.
  • Numero de spots: dependiendo del organismo y su estado metabólico se obtendrán 10,000 y 150,000 productos de genes
  • Espectros del punto isoeléctrico: pH 3-13, sin embrago en la práctica este rango es técnicamente problemático por lo que se utiliza un pH máximo de 11.5
  • Reproducibilidad: es de gran importancia pues de lo contrario es imposible encontrar variaciones proteicas entre diferente muestras.

Limitaciones

  • Técnica muy laboriosa y difícil de automatizar
  • No resuelve proteínas muy grandes o hidrofóbicas (no entran al gel 1D)
  • Proteínas muy ácidos o muy básicas no se resuelven bien.
  • Detección deficiente de proteínas poco abundantes (proteínas regulatorias, receptores).

Aplicaciones futuras

  • Análisis y caracterización de subproteomas
  • Caracterización de complejos proteicos.

 1D: isoelectroenfoque

  • Separación en base a la carga neta de una proteína
  • Principio: electroforesis se realiza en un gradiente de pH, permitiendo que cada proteína migre de acuerdo a su punto isoeléctrico (pI).
  • pH>pI: carga negativa
  • pH=pI: carga neutra
  • pH
  • Ánodo tiene carga positiva
  • Cátodo tiene carga negativa

Como se establece el gradiente

  • Empleo de anfolitos portadores sintéticos: que son pequeñas poliaminas (cerca de 750kDa) con abundante grupos ácidos y básicos. Con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0
  • Tienen una alta capacidad de tamponamiento y solubilidad cerca del pI
  • Buena conductividad eléctrica
  • Ausencia de efectos biológicos
  • Bajo peso molecular
  • Síntesis química para su preparación

Principio del IEF

  • La disolución de anfolitos se emplea en la preparación de un gel de poliacrilamida.
  • Al aplicar una diferencia de potencial cada molécula de anfolito migrará hacia uno u otro polo en función de su carga, hasta alcanzar la zona de su pI.
  • Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo largo del gel.

Limitaciones del uso de anfolitos

  • Las moléculas no se unen covalentemente al gel.
  • Para asegurar que los anfolitos se encuentren en el pI correcto, se necesita un tiempo largo de migración.
  • Debido a lo anterior, se puede presentar la deriva catódica (desplazamiento de los anfolitos)
  • Se puede minimizar adicionando urea y glicerol para equilibrar la solución evitando la formación del H3O.

Para evitar la deriva catódica, se creó el Gel IPG cuyo gradiente de pH se encuentra inmovilizado mediante las “inmobilinas”

  • Monómeros derivadas de acrilamida que contienen grupos carboxilo y amino cuaternarios.

Ventajas del uso de anfolitos

  • Geles en tubo utilizados para anfolitos son fáciles de preparar y no se requiere de equipo sofisticado
  • Su eso solo implica el mezclar los anfolitos y la optimización en el rango de pH deseado
  • Se tiene una alta resolución de proteínas si se utilizan geles de tubo delgados y la reproducibilidad de los gradientes puede ser excelente.

Desventajas de los anfolitos

  • Reproducibilidad baja de anfolitos (lote a lote), debido a que la síntesis química es larga y complicada
  • Sin embargo la misma puede presentarse en el IPG
  • Presenta deriva catódica (no equilibrio real del gradiente de pH). Aunque el efecto puede minimizarse si las separaciones IEF se estandarizan con respecto al voltaje/hora.

Ventajas de las inmobilinas

  • Reduce la variación debido a la producción industrial
  • Gradiente no se modifica por la composición de la muestra y no presentan deriva catódica con el tiempo
  • Gradientes estables a pH básico lo que permite una separación y resolución reproducible de proteínas básicas
  • Alta resolución espacial con intervalos de pH muy pequeños (0.01 unidades) lo que es necesario para la identificación y caracterización de proteínas.

  2D:SDS-PAGE

definición

  • Técnica que permite separar proteínas en base a su peso molecular, por lo que es necesario utilizar agentes desnaturalizantes.
  • El SDS rompe todas las interacciones hidrofóbicas de las proteínas para poder exponerlas a la carga formando complejos aniónicos, lo que hace que la migración ocurra hacia el ánodo
  • Las proteínas y el SDS forman una estructura en la cual el SDS está incorporado a la proteína en un relación 1.4 SDS X 1g de proteína
  • ß-mercaptoetanol rompe puentes disulfuro Cys-S-S-Cys
  • agentes caotrópicos como la urea rompe puentes de hidrogeno en la superficie de la proteína y causa desnaturalización parcial (cancela estructura secundaria y terciaria)

 el gel

  • la concentración de acrilamida (%T) determina la longitud promedio de la cadena del polímero
  • la concentración de bisacrilamida (%C) determina el grado de entrecruzamiento
  • en conjunto determinan las características físicas del gel resultante
  • la relación normalmente es de 5:1
  • separación de proteínas pequeñas (<50kDa) 10-15%T
  • proteínas de mayor tamaño: <10%T acrilamida
  • siempre es necesario probar y optimizar

limitaciones

resolución

  • aunque la electroforesis bidimensional permite distinguir alrededor de 2000 proteínas en un análisis, el proteoma de una célula eucariótica es mucho  mayor lo que vuelve el análisis muy complejo.
  • Como mejorarla?
  • Incrementar la longitud de los geles
  • Geles en tubo IEF >30cm para asegurar una máxima separación 1D
  • En combinación con Geles-SDS de >30cm, aunque son difíciles de manejar, permiten separar hasta 10,000 spots.
  • Empleo de geles zoom
  • Múltiples geles IEF cada uno con un rango de pH seguidos de SDS-PAGE y un análisis de imagen.
  • Las imágenes de cada gel pueden agruparse por computadora para resolver el proteoma entero de un organismo.

Sensibilidad

  • dificultad para detectar proteínas escasas
  • proteínas abundantes pueden enmascarar aquellas manchas producidas por proteínas escasas
  • como mejorarla?
  • Empleo de geles zoom
  • Se permite una mejor separación de proteínas con propiedades electroforéticas similares
  • El empleo de una gama estrecha de geles IPG mejora el enmascaramiento de proteínas escasas ya que  es posible cargar mas muestras en el gel.

 Detección de spots

...

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