Biologia Molecular

Índice

1. Introducción

2. Estructura del DNA

3. Aspectos básicos de la Biología Molecular

4. Desarrollo

5. Técnica de PCR

6. Optimización de la técnica de PCR

7. Aplicaciones de la Técnica de PCR

8. Bibliografia

INTRODUCCIÓN

Para abordar de lleno el tema de la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) debemos hablar primero de Biología Molecular, esta es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de uno seres a otros y se exprese en los nuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales que existen entre las especies y "colocar" genes de un organismo otro llamado hospedero, empleando técnicas de ingeniería genética. Gracias a este avance, se pueden producir fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo así las puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores recombinantes.

Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con hechos que contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo de la biología molecular, por ejemplo:

o En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregación y clasificación independiente de los genes.

o En 1869 Frederick Miescher, científico suizo descubre en el núcleo de las células una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleína.

o En los años veinte el químico alemán Robert Feulgen, utilizando una tinción específica descubrió que el DNA estaba situado en los cromosomas.

o En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el DNA es el portador de la información genética.

o En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del DNA.

Este último hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos que conducirían a lo que se llama tecnología del DNA Recombinante

Hablando específicamente de DNA según el modelo de Watson y Crick, la molécula está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado por:

1.- Molécula de azúcar (desoxirribosa)

2.- Base orgánica nitrogenada: bases pirimídicas (Citosina, timina), bases púricas (Adenina, Guanina).

3.- Grupos fosfato.

Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando cadenas muy largas, quedando las bases nitrogenadas en la parte central unidas cada una al carbono 1 del azúcar formando un ángulo recto con su eje.

Las cadenas de poli nucleótido que constituyen una molécula de ADN se mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas.

Estructura primaria del DNA

La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos. Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido nucleico, se representa mediante la terminología de cada una de las bases. Por ejemplo:

5 -ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3

Esta secuencia representa un oligonucleótido con veinte bases, de las cuales seis son Adenina (A), tres son Timina (T), ocho son Citosinas (C) y tres son Guanina (G).

El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5 3 o

3 5 ; el 5 representa el extremo terminal del fosfato y el 3 el extremo final del átomo de carbono de la desoxirribosa.

Estructura secundaria del DNA

El DNA es una doble hélice antiparalela ya que el enfrentamiento entre las bases nitrogenadas es constante; la Adenina siempre se enfrenta con la timina formando dos puentes de hidrógeno y la Guanina siempre se enfrenta con la Citosina formando tres puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5 3 y la otra lo hace en sentido 3 5.

Estructura terciaria y cuaternaria del DNA

Recordemos que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior de las células. Estas estructuras, terciaria y Cuaternaria, permiten el empaquetamiento del DNA formando los cromosomas. En las células eucariotas existen varios cromosomas y en los procariotas, existe un DNA empaquetado denominado pseudocromosoma.

Aspectos básicos de la Biología Molecular

La aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de Ingeniería genética y referidas indistintamente como clonación, DNA recombinante o manipulación génica han sido la causa de pocas áreas de la biología molecular permanezcan inalteradas. Antes del desarrollo de la ingeniería genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto.

Una de las sustancias mas importantes y de participación decisiva en distintos procesos de la Biología Molecular son las enzimas; existen varias que podemos destacar:

Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleótidos del interior de la cadena. Son producidas principalemnete por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto del DNA de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las mas útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura. Estas enzimas se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras e la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa generación.

Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromes. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario. Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5 de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.

Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA "in Vitro". La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula

...