LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Materia: LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Practica N°: 1

1. TEMA: EXTRACCIÓN DE ADN

2. OBJETIVOS:

OBJETIVO GENERAL: Realizar la extracción de ADN de hojas de acelga siguiendo la técnica que emplea DNAzol.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Utilizar DNAzol Reagent para aislar el DNA en un solo paso.

 Conocer la técnica que se debe seguir para extraer ADN con el reactivo DNAzol.

 Identificar las etapas del proceso de extracción de DNA.

 Reconocer la importancia de la extracción de ADN en técnicas moleculares.

3. INTRODUCCIÓN o MARCO TEORICO:

El ácido desoxirribonucleico es un conjunto de subunidades denominadas nucleótidos los cuales se replican y traducen cuando es necesario para formar proteínas las cuales están en la capacidad de cumplir numerosas funciones ya sea como catalizadoras, transportadoras, constituyentes, estructurales, entre otras que mantienen al ser vivo. [1]El investigar, analizar y experimentar con ADN permite conocer el porqué de varios procesos, reacciones, expresiones fenotípicas inclusive de comportamiento de un ser vivo en particular, los resultados pueden tener varios tipos de aplicaciones.[2] Los factores que pueden afectar el rendimiento calidad y pureza del ADN pueden ser la cantidad de material de partida, las condiciones en las que se encuentra el material (fresco, congelado, fijado), contaminantes e interferencias en el material biológico que pueden degradar el DNA [3]como polisacáridos y polifenoles.

Existen varios métodos para la extracción del DNA pero de manera general se debe seguir pasos específicos como:

♦Lisis celular: Empleo de fuerzas de fricción, termodinámica, detergentes y sales caotrópicas que ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas consiguiendo su desnaturalización.

♦Purificación: Serie de centrifugaciones e incubaciones con diferentes tipos de solventes que eliminan restos de proteínas y recuperan todo el DNA posible.

♦Precipitación: Se logra con soluciones de etanol 95% e isopropanol.

♦Lavado: Con etanol al 75% [4]

Actualmente las técnicas de biología molecular permiten la extracción del DNA para someterlo a varios tipos de estudios y experimentos siguiendo protocolos que se encuentran definidos; dependiendo de la calidad del ADN que necesitemos y de la muestra biológica que se vaya a estudiar el protocolo necesita de mayor complejidad en cuanto a reactivos y equipos, [2]por ejemplo no se debe utilizar precipitación con acetato de sodio si el DNA va a ser fosforilado con una nucleasa polinucleotídica, o uso de cloruro de sodio si hay SDS en la solución ya que esta sal permite que esta sal permanezca en la solución en presencia de etanol[5,].

Los posibles reactivos a usarse se exponen en la tabla 3.1.

Reactivo Nombre Función

Detergentes Sodio dodecilo sulfato Solubilisa proteínas tejidos y membranas

Triton X

Molécula quelante EDTA Forma completamente desprotonizada se une a complejos metalicos en solución quitando quitando a los cationes de la solución para desestabilizar la membrana celular e inhibir a las DNAasas

Sales NaCl Forma una acapa iónica suave que recubre al DNA protegiendolo para evitar su degradación

KCl

perclorato de Sodio Degradación y precipitación de la fración protéica asociada al DNA

Cloruro de litio

Cloruro de sodio

Acetato de sodio

Acetano de amonio

Acetato de potasio

Lauril Sulfato de sodio Despolariza las proteínas

Tampón Tris-HCl pH entre 7,5 y 8,2 para mantener el pH de la solución estable

Alcoholes Etanol Precipitación del ADN, eliminara las sales que se agregó

Isopropanol

Fenol Extracción de péptidos y proteínas en la fase orgánica

Enzima Proteinasa K Digestión de peptidos y proteinas

Solvente orgánico Cloroformo Elimina residuos lipídicos

Tabla 3.1 Diferentes tipos de reactivos empleados para la extracción de ADN . [3,4, 5]

Uno de los métodos empleados para la extracción de DNA es el DNAzol, este es un kit que ya viene preparado y el procedimiento consta en el uso de una solución de lisado conteniendo detergente y guanidina que hidroliza y promueve la precipitación selectiva del DNA del lisado celular. Este método es eficiencia y reproducibilidad, simple y rápido, además de ser no tóxico, el empleo del kit DNAzol evita el uso de fenol que es latamente toxico. El tiempo que conlleva realizar la extracción es entre 10-30 minutos con una tasa de recuperación de 70- 100 %. El DNA aislado puede ser usado para Southern, hibridización dot blot, clonado molecular y PCR.

4. MATERIALES Y MÉTODOS:

Equipos y Materiales del Laboratorio REACTIVOS MATERIAL BIOLÓGICO

Espatula

Mortero

Pistilo

Tubos Eppendorf

Micropipetas

Puntas de micropipetas Centrifuga refrigerada

Vasos de precipitación

Gradillas

Guantes

Marcador permanente

Toallas desechables DNAzol

Cloroformo

Etanol 99%

Etanol 70%

TE ph=8 Hojas de acelga

PROCEDIMIENTO:

• Lisis membranas y pared celular.

Tomar aproximadamente 0,50 g de la muestra a la que se extraerá el ADN.

Macera la muestra con nitrógeno líquido (T=-196°C) en morteros y pistones que hayan estado congelados a 4°C.Evitar que la muestra se oxide.

• Homogenización muestra.

Colocar polvo con espátula en los tubos ependor (1,5ml)

Añadir 1ml de DNAzol

Homogenizar por inmersión suavemente hasta obtener una sola fase.

Incubar los tubos de 5 – 10 min.

• Purificación.

Añadir 300 μm CHCl3 se notaran dos fases

Centrifugar 14000 rpm durante 10 min a 4°C.

Tomar el sobrenadante y trasferir a otro tubo ependor.

• Precipitación.

Añadir 0,5 ml etanol al 100%

Homogenizar un par de veces por inmersión.

Incubar a temperatura ambiente 2 minutos

Centrifugar a 4000 rpm 2 min -4°C de la temperatura ambiente.

Desechar el sobrenadante por decantación, evitando perder la muestra que se encuentra en las paredes.

• Lavado.

Añadir 1ml etanol al 70%, homogenizar por un par de inmersiones y decantar, repetir el paso dos veces.

Secar a temperatura ambiente los tubos epedor hasta que todo el alcohol se haya evaporado y las paredes del mismo se encuentren secas.

Resuspender la muestra en tris-HCl para poder mantener el ADN estable.

...