Laboratorio de Biología Molecular

Laboratorio de Biología Molecular

Betsai González Molina

2112046985

Equipo: “5”

José Francisco Miranda Hernández

EXTRACION DE ADN

Objetivo.

Separacion de carbohidratos, lípidos, proteínas y ADN.

Resumen.

Los acidos nucleicos reciben este nombre porque fueron los primeros que se

descubrieron en el nucleo de las celulas; se trata de moleculas organicas gigantes que contienen carbono, nitrogeno, hidrogeno, oxigeno y fosforo. Los acidos nucleicos son de dos tipos: el primero, el acido desoxirribonucleico (ADN), constituye el material genetico dentro de la celula. Cada gen es un segmento de una molecula de ADN. Nuestros genes determinan los rasgos que heredaremos y, que mediante el control de las sintesis de proteinas, regulan las actividades que tienen lugar en nuestras celulas a lo largo de la vida y, el segundo el acido ribonucleico (ARN).

La molecula de ADN es lineal sin ramificaciones, forma hebras largas, esta formada por dos cadenas de polinucleotidos enrolladas alrededor del mismo eje, comunmente conocida como doble helice con giro a la derecha, cada una de ellas esta formada por los fosfatos al exterior en contacto con el medio acuoso, estos se unen en el C5 y C3 de un azucar de cinco atomos de carbono llamado desoxirribosa se une a cada base en el ADN.

Las bases puricas y pirimidicas se enlazan en el extremo opuesto del azucar; las cuatrom bases son: Adenina (A), Guanina (G), Tiamina (T) y Citosina (C). La adenina y la guanina son bases grandes de anillos dobles llamadas purinas; la timina y la citosina son bases mas pequenas de un solo anillo denominadas pirimidinas; se situan en la parte interna de la molecula, quedando perpendicularmente al eje, se enlaza una base purica con una pirimidica por medio de puentes de hidrogeno, lo que le da mayor resistencia a la desnaturalizacion.

Las cadenas de ADN son antiparalelas, es decir siguen direcciones opuestas, una va en sentido 5’ a 3’ y la opuesta en direccion 3’ a 5’.

Al enrollarse las cadenas, se forman dos surcos o hendiduras paralelos a los girosde la helice, uno mayor que el otro. En estos sitios las proteinas interactuan con los atomos de los nucleotidos y controlan la expresion de genes especificos. La estructura mencionada se denomina configuracion B, si las condiciones fisiologicas se alteran, poca sal o hidratacion elevada, la doble helice cambia de forma y adquiere conformacion A, C, D, E y Z. La configuracion B es la mas estable y contiene por cada vuelta 10 pares de bases, se observa in vivo. La configuracion A es la mas torcida, tiene 11 pares de bases por cada vuelta, las bases estan inclinadas 20 grados de la perpendicular al eje de la helice, fue laprimera obtenida in vitro. La configuracion C es estrechamente espiralaza, compacta, tiene 9 1/3 pares de bases, la posicion de los nucleotidos es diferente. La configuracion Z tiene un giro a la izquierda, el eje esta en zigzag, es poco estable ya que diferentes partes de la molecula quedan expuestas.

        ¿Que se hizo? El proceso de extracción del DNA geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas en la estructura de estos dos tipos de macromoléculas.

El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.

El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y proteínas.

La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interface. La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se aísla de las demás moléculas conforme sale de la solución.

En la interface el RNA sale de la solución salina.

En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa.

Enseguida sale la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.

La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación.

Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a sus cargas.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué reacción cataliza la lisozima?

La lisozima es una enzima que rompe las paredes celulares de las bacterias, lo hace hidrolizando enlaces glucosídicos. La estructura del peptidoglicano es resistente a la acción de enzimas L-proteasas, tales como la tripsina y la quimotripsina, ya que éstas no atacan a los péptidos que contienen D– aminoácidos. La lisozima es una enzima capaz de lisar las cadenas polisacáridas del peptidoglicano de la pared celular de bacterias Gram-positiva, hidrolizando el enlace Beta 1-4 glicosídico existente entre el ácido N- acetilmurámico y la N-acetil-glucosamina. Los productos de la acción de la lisozima son disacáridos de la N-acetil glucosamina y del ácido N-acetil murámico que todavía se hallan unidas a las cadenas laterales peptídicas. Una vez escindido el esqueleto de esa manera, la célula se hincha con la ruptura de la membrana hay pérdida del contenido celular y ocurre la muerte bacteriana. En las bacterias Gram-negativas, la capa de peptidoglicano es mucho más delgada. Aunque está presente la misma estructura básica de polisacáridos, las cadenas peptídicas y sus uniones son algo diferentes.

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