Cuaderno laboratorio biologia molecular

PRÁCTICA 1: ÍNDICE MIÓTICO

Índice Mitótico Está plenamente demostrado que la alteración de la proliferación celular es la causa principal de varios tipos de enfermedades neoplásicas (Machado-Santelli, 2000). En las plantas superiores los meristemos proliferan siguiendo una cinética en equilibrio dinámico, lo que puede evaluarse a través de una serie de indicadores tales como: la velocidad de crecimiento, la población de células en división celular, la duración del ciclo celular, el índice mitótico y la frecuencia de células en los diferentes estados morfológicos, entre otros (López-Sáez, 1965)

Los meristemos de Liliáceas, como la cebolla, son frecuentemente utilizados para estudios de la dinámica celular porque constituyen un sistema in vitro ideal (Giménez-Martin 1977); así como para estudiar los mecanismos regulatorios que afecten el ciclo celular (Rosth, 1977). Actualmente se conoce como “Allium test” y se utiliza para determinar los efectos de diferentes xenobióticos o principios activos obtenidos de plantas y animales. El índice mitótico se define como el cociente entre el número de células que se encuentran en mitosis y el número total de células (células en mitosis y células en interfase). Se calcula como: IM = (CM/CT) • 100 donde: IM: índice mitótico CM: número de células en división mitótica CT: número de células totales observadas * Nota: se deben contar varios campos con el objetivo de 40x. Hasta que no se han contado todas las células de un campo, no se pasa al siguiente.

ÍNDICE DE FASES

El índice de fases nos indica el porcentaje de células que se encuentran en una determinada fase en un tejido. Es necesario calcular el índice de fases debido a que las células son asincrónicas, es decir, realizan su ciclo celular independientemente del resto. El indice de fases se determina como el cociente del número de células en una fase determinada con el número de células en mitosis por 100. Se calcula de la siguiente manera:

Índice de Profase:

IP = (CP/CM) • 100

CP : Número de células en profase

CM: Número dé células en mitosis

Índice de Metafase:

IME = (CME/CM) • 100

CME : Número de células en metafase

CM: Número dé células en mitosis

Índice de Anafase:

IA = (CA/CM) • 100

CA : Número de células en anafase

CM: Número dé células en mitosis

Índice de Telofase:

IT = (CT/CM) • 100

CT : Número de células en telofase

CM: Número dé células en mitosis

PROTOCOLO DE TINCIÓN:

FUNDAMENTO:

MATERIALES:

• Vidrio de reloj

• Tijeras

• Mechero

• Pinzas

• Portaoobjetos

• Pinzas de mechero

• Cebolla

• Orceína A

• Orceína B

• Pipeta Pasteur

• P1000

PASOS:

IMÁGENES DE LAS CÉLULAS EN SUS DIFERENTES FASES:

PRÁCTICA TAMPON FOSFATO SÖRENSE

PREPARACION DEL TAMPON FOSFATO SÖRENSEN

INTRODUCCIÓN

El tampón fosfato Sörensen es una solución amortiguadora o tampón que se usa en biología moléculas en técnicas de bandeo R o Reverso.

Está compuesto por una solución (A) de Fosfato Sódico Monobásico (NaH2PO4) y por una solución (B) de Fosfato Sódico Dibasico (Na2HPO4) de distintas proporciones según el pH que queremos mantener de modo que:

Xml de A + Yml de B = pH

Según se establece en la siguiente tabla:

X = (A) de Fosfato Sódico Monobásico (NaH2PO4)

Y = (B) de Fosfato Sódico Dibasico (Na2HPO4)

x y pH x y pH

93.5 6.5 5.7 45.0 55.0 6.9

92.0 8.0 5.8 39.0 61.0 7.0

90.0 10.0 5.9 33.0 67.0 7.1

87.7 12.3 6.0 28.0 72.0 7.2

85.0 15.0 6.1 23.0 77.0 7.3

81.5 18.5 6.2 19.0 81.0 7.4

77.5 22.5 6.3 16.0 84.0 7.5

73.5 26.5 6.4 13.0 87.0 7.6

68.5 31.5 6.5 10.5 90.5 7.7

62.5 37.5 6.6 8.5 91.5 7.8

56.7 43.5 6.7 7.0 93.0 7.9

51.0 49.0 6.8 5.3 94.7 8.0

Por ejemplo, para prepara 100 mL de tampón Sörensen a pH 6,5 debemos añadir 68,5 mL de solución A y 31,5 mL de solución B.

En esta práctica prepararemos 250 ml de solución A 0,2 molar (M) y 250 ml de solución B 0,2 M.

Posteriormente a esto prepararemos tampones de pH 6, 7 y 8 a partir de los reactivos que se tienen en el laboratorio. Comprobaremos los pH con ayuda del pHmetro.

Envasaremos el producto obtenido en un frasco de color topacio (para preservarlo de la luz) y colocaremos una etiqueta con el nombre del reactivo y la fecha de la realización.

MATERIALES:

• 2 Matraz aforado 100 ml

• Probeta 100 ml

• Balanza

• Agitador magnético

• Imanes

• Éspatula

• Vidrio de reloj

• Embudo

• Pinzas

• Pipetas Pasteur

• Vaso de precipitado

• Pipetas de 10 ml y de 5 ml

• Fosfato monosódico(NaH2PO4)….A

• Fosfato disódico(Na2HPO4)……B

PASOS:

 Calcular los gramos que usaremos.

A: 0,2M= ns/0,1L= 0,02mol 0,02moles= m/120 g/mol= 2,4gr del reativo A

B: 0,2M= ns/0,1L= 0,02mol 0,02moles= m/141,96g/mol=2,83g r del ractivo B

 Pesamos las cantidades en la balanza con el vidrio de reloj.

 Una vez finalizado el paso anterior echamos en 2 vasos de precipitado las sustancias con un poco de agua destilada

 Ponemos los vasos con un imán dentro en el agitador magnético.

 Vertemos el contenido de los vasos en los mataces aforados de 100ml enrasando con la pipeta.

 Por ultimo según el PH que querramos obtener nos guiaremos con la tabla y lo iremos vertiendo en la probeta de 100ml

 Finalmente lo vertemos en un bote etiquetándolo con la fecha y el nombre del reactivo

Para comprobar el PH meteremos unas tiras reactivas.

PRÁCTICA 3: REALIZACIÓN DE UN CARIOTIPO ESTÁNDAR.

CARIOTIPO EN SANGRE PERIFÉRICA

OBJETIVO: La realización del cariotipo se realiza para el diagnóstico de defectos cromosómicos mediante el análisis del número y estructura de los cromosomas al microscopio.

Las anomalías cromosómicas constitucionales están presentes en 1 de cada 120 nacidos vivos y aproximadamente

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