Biologia

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Introducción

Todo nuestro entorno natural puede ser observado por niveles de organización. Cada uno de estos niveles posee características propias de su nivel que los hace diferentes a los demás. Uno de los tantos niveles es, el nivel celular, donde las primeras células eran relativamente simples y pequeñas, similares a lo que conocemos actualmente como procariontes. Luego de estas aparecieron las células eucariontes, las cuales eran más grandes y con una organización en su interior más compleja, a la que perteneces animales y plantas.

Las técnicas microscópicas, han confirmado que las células eucarióticas contienen, en verdad, una multitud de estructuras. No son, por supuesto, órganos como los que se encuentran en los organismos multicelulares, pero en cierta forma son comparables; ya que están especializados en forma y función para desempeñar actividades particulares requeridas en la célula. A estos “órganos” contenidos dentro de la célula, los llamamos organelos, y forman parte de la organización subcelular [1].

El citoplasma de las células eucariontes comprende la sustancia celular que se encuentra dentro de la célula. Aquí ocurren las reacciones metabólicas, ya que este contiene numerosos componentes de la célula. Contiene al citosol, que es la parte soluble del citoplasma [2].

El núcleo, es el organelo más grande de la célula, tiene una envoltura nuclear de 2 capas: una membrana nuclear externa e interna, las cuales están perforadas por poros nucleares, a través de los cuales de comunica con el citosol. Además contiene todo el DNA cromosomal en cromatinas, por la asociación a la proteína histona [3].                                              

La membrana plasmática es una bicapa lipídica que delimita todas las células. Tiene dos láminas de fosfolípidos, glucolípidos y proteínas. Regula la entrada y salida de sustancias entre el citoplasma y el medio extracelular.

Las mitocondrias son similares a las bacterias, se dice que se produjeron por simbiosis (unión de una célula eucarionte primitiva y un organismo procariótico). Degradan moléculas orgánicas productores de energía, y encargada de la respiración celular.

Los cloroplastos, al igual que las mitocondrias, también tendrían un origen simbiótico. Se encuentran sólo en organismos que realizan fotosíntesis, en ellos se transforma la energía lumínica en energía química, que puede ser aprovechada por los vegetales.

El retículo endoplásmico, está dividido en dos compartimientos; retículo endoplásmico rugoso (R.E.R) con ribosomas en su parte externa y encargado de la síntesis de proteínas, y el retículo endoplásmico liso (R.E.L) sin ribosomas, que se encarga del metabolismo de lípidos.

El Aparato de Golgi, está constituido por cisternas discoidales, que se encargan de la distribución y envío de los productos químicos de la célula. Modifica proteínas y lípidos (grasas) que han sido construidos en el retículo endoplásmico y los prepara para ser expulsados fuera de la célula [4].

Los lisosomas son vesículas membranosas que se encargan de la digestión celular, a través de enzimas hidrolíticas, aisladas dentro, para que no degraden moléculas necesarias.

Los peroxisomas, mantienen aislado el peróxido de hidrógeno () que se produce mediante la oxidación sustancia peligrosa y lo separa de los otros componentes celulares.

Los ribosomas, son complejos macromoleculares de proteínas y RNA, encargado de sintetizar proteínas a partir de la información genética que les llega del DNA transcrita en forma de RNA mensajero.[pic 6]

El citoplasma está formado por filamentos de proteínas (filamentos de actina, filamentos intermediarios y microtúbulos) que otorgan forma y movimiento a la célula.

Cuando se requiere el estudio de los componentes específicos de las células se recurre a la técnica del fraccionamiento subcelular. Este es un conjunto de métodos y técnicas que permite obtener fracciones puras o enriquecidas del componente que queremos estudiar, ya sea éste un orgánulo, una fracción de membrana o complejos multiproteicos. Contiene dos pasos, primero es la ruptura u homogenización de la muestra, esta puede ser mediante varios métodos: sonicación (exposición a sonidos de alta frecuencia), shock osmótico o moliendo la célula en un homogeneizador mecánico. Y segunda es el procedimiento de fraccionamiento de los componentes de las células por centrifugado, después de ello se obtiene un precipitado o pellet que según a la velocidad y tiempo que este se mantenga en la centrifugadora  y cuantas veces la muestra ha sido centrifugado es posible determinar el contenido de su pellet, también obteniendo una parte semilíquida llamada sobrenadante contiene partes de los organelos sin centrifugado.

Para hacer más eficiente el análisis de una muestra, existen moléculas marcadoras, las cuales existen ya que cada organelo o componente tiene enzimas o moléculas únicas las que permiten ser identificadas por estas moléculas marcadoras como por ejemplos: el ADN es la molécula marcadora para identificar núcleos, para la clara observación de esta se utilizan colorantes básicos como azul de tripán, azul B y azul toluidina.

En este informe, se aprovechara toda la información obtenida durante el práctico en el laboratorio y además la información recopilada, para responder las diversas preguntas que nos hicimos durante ese momento como ¿Por qué se logran ver núcleos mediante una tinción? ¿Por qué se utiliza el baño termorregulado en marcadores moleculares?

Por otro lado, la mala manipulación de elementos en un fraccionamiento, hace que el resultado esperado al inicio, no funcione al 100%, así arrojando otro resultado.

Objetivos

• Comprender la organización subcelular y quienes la componen.
• Aprende la técnica del fraccionamiento subcelular, mediante el rompimiento de la célula y la separación de los organelos por el campo gravitacional.
• Comprender el uso de diversas moléculas marcadoras especiales de cada organelo.
• Aprender a usar herramientas para el rompimiento de células y centrífugas.
• Conocer la fracción nuclear, mitocondrial y microsomal.

Materiales y Métodos

Las actividades siguientes se relacionaron entre sí, de la primera actividad se pasó a la segunda, y de la segunda actividad a la tercera.

Actividad 1: a) Se realizó un fraccionamiento sub celular. Se recibió un homogenizado filtrado, preparado por los profesores, el cual de obtuvo de un trozo de hígado de pollo frio a 4°C. Se dejó libre de sangre usando PBS o NaCL 0.9% (suero fisiológico) frio. Se picó el hígado en trozos pequeños utilizando tijeras. Se descartó el suero fisiológico utilizado anteriormente y se reemplazó por IBc frio fresco y se transfirió la suspensión al tubo de homogenizado (mortero) y se operó a 1600 RPM. Luego se enfrió el tubo de homogenizado en hielo antes de iniciar el procedimiento.

Se transfirieron 10 ml del homogenizado a un tubo falcon 1, y este se centrifugó a 2500 RPM por 10 minutos. Este tubo 1 quedó con un sobrenadante 1 y un pellet 1, el pellet 1 que contenía la fracción nuclear, se dejó aparte para la actividad b) , y el sobrenadante 1 se siguió utilizando para la siguiente centrifugación. Luego se utilizó solo el sobrenadante 1, se colocó en un tubo falcon 2 y se centrifugó a 6000 RPM por 20 minutos. Este tubo 2 quedó con un sobrenadante 2 y un pellet 2, en este caso el sobrenadante 2 se descartó del procedimiento, y al pellet 2 se le agregó 5ml de suero. Luego este homogenizado se colocó en un tubo falcon 3 el cual se centrifugo a 6000 RPM por 20 minutos. Este tubo 3 quedó con un sobrenadante 3 y un pellet 3, el pellet 3 contenía la fracción mitocondrial y se ocupó para otra actividad y el sobrenadante 3 que contenía la fracción microsomal se usó también para otra actividad. Recordar que durante toda esta actividad se dejó en hielo, para mantener una temperatura fría, y que las muestras no se alteren.

b) Se realizó una evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares y observados en microscopio. Primero en un portaobjetos limpio y seco, se colocó una gota del pellet 1 que se mantuvo en hielo, la cual contenía la fracción nuclear de la actividad anterior, se colocó sobre el un cubreobjetos y se observó en el microscopio usando un objetivo de 40X. Luego se preparó otro portaobjetos limpio y seco con una gota del pellet 1 de fracción nuclear y además se le agregó una gota de azul de tripán (marcador de núcleos), se coloca sobre el un cubreobjetos y se observa en el microscopio usando un objetivo de 40X.

Actividad 2: Se realizó una evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares en tubos de ensayo. En primer lugar se separan 4 tubos de ensayo, se rotulan adecuadamente y se mantienen en hielo. A los tubos de ensayo 1, 2, 3, 4 se le agrego 1ml de succinato (marcador de mitocondrias), 1 ml de azul de metileno (marcador de electrones y protones), 1 ml de agua destilada. Al tubo 1 no se le agrego nada adicional, al tubo 2 se le agregó 1ml de fracción nuclear, al tubo 3 se le agregó 1ml de fracción mitocondrial y al tubo 4 se le agregó 1 ml de fracción microsomal. Se agitó el contenido de cada tubo y a cada tubo se le agregó 1 ml de vaselina liquida. Finalmente se colocaron los tubos en el baño termo regulado por 15 minutos a 37°C.

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