Biotecnologia.

Modulo #1:  Introducción de los procesos “DownStream”

•  Los productos derivados de sistemas biológicos, provenientes de proteínas, es una complejo y estos requieren de: excelente planificación, investigación, análisis, monitoreo y cuidados considerables.
• “DownStream” –  procesos finales, que siguen luego de que se ha logrado la purificación de las proteínas o metabolitos de interés.

• Se relaciona con las etapas de: separación y purificación.

• Repaso: “UpStream” –  Proceso que permite las condiciones necesarias para lograr un cultivo de células o un proceso de fermentación, efectivo.
•  Luego de que se haya logrado que las células o sepas productoras de generar la sustancia de interés siguen los procesos “DownStream”.
• Los procesos “DownStream” comienzan con:

• Recuperación del producto.
• Proceso de separación del producto de interés a un grado de pureza adecuado.
• Completar el producto final.

•  Visión general de los procesos “UpStream”:

• La confección de un producto de naturaleza biotecnológica requiere investigación, análisis y el desarrollo de procesos de forma cuidadosa.
•  Metabolitos con fines terapéuticos requieren de:

• Establecimiento de un sistema de producción, tiene su base en la línea celular o sepa microbiana productora.

• Una vez se obtiene la línea productora, se establece entonces, las condiciones requeridas para su crecimiento y mantenimiento óptimo.

• Los medios de cultivo, sin los nutrientes adecuados una célula no va a poder realizar funciones de producción que son esperadas.
• Biorreactor o fermentador,  para permitir que las células productoras crezcan eficientemente y puedan producir la sustancias de interés.
• Importante:  Evitar la contaminación.

• “UpStream”  tiene un efecto directo en las etapas “DownStream”.
• Componentes de proceso “DownStream”:

• Permite obtener el producto de interés, eliminar las impurezas y generar un producto final con las mejores características en términos de identidad, calidad, pureza y efectividad.

• Cada industria establece de forma secreta cómo se van a realizar estos procesos (“DownStream”).

• Se componen de los siguientes procesos:

• Recuperación del producto de interés y remoción de desechos insolubles.
• Purificación (incluye varias etapas)
• Etapas de terminación del producto:

• Formulación
• Llenado / Terminado y Empaque
• Distribución de los productos

• Antes de construir las facilidades en las que se operan, las compañías planifican tanto sus procesos “UpStream” y “DownStream”.
• Criterios considerados por las industrias:

• Naturaleza del producto /  metabolito que se va a generar.
• Función del producto
• Requisitos de pureza, calidad y efectividad
• Destrezas que se requieren de los empleados.
• Instrumentación y tecnología necesaria.
• Necesidades del negocio (coto-efectividad).

• La mayoría de estos casos requieren una combinación de procesos y tecnologías que puedan cumplir con la generación de un metabolito de alta calidad.
• Descripción general de las etapas “DownStream”:

1. Recuperación o Extracción –  Donde se generó la sustancia de interés (intracelular o fuera de la célula productora), y se establecen procesos para obtener la molécula de interés.
2. Remoción de Contaminantes – es decir clarificación y concentración; remover todos los elementos insolubles no deseados (para disminuir el volumen de trabajo).

• Estas primeras dos etapas, son comunes tecnologías para ruptura o desestabilización celular o tecnologías versátiles como es el caso de la filtración.

1. Purificación – Es una técnica más o menos compleja, el propósito es ir aumentando progresivamente la calidad del producto de interés (se incorpora métodos de baja y alta resolución).
2. Biomanufactura de Terminación – Tiene como propósito general el producto tal cual irá al mercado, el producto en su forma bruta, pero puro y con alta calidad, llega inicialmente a una etapa de formulación.
3. Formulación – En esta etapa se lleva el producto a un nivel de estabilidad efectivo y se le añaden diversas sustancias para lograr que el producto sea más duradero, sea mejor tolerado por los pacientes, que tenga la fortaleza requerida (ingrediente activo).
4. Luego que el producto sea formulado, la industria tiene que terminarlo, llevarlo a la presentación. De esto dependerá si el producto será distribuido de forma líquida o no. Una vez el producto es llenado por finalizado, pasa al área de empacado, se coloca la información requerida en etiquetas y el empaque con el que será distribuido al mercado.

• La operación “DownStream”  es altamente regulada y requiere de un proceso libre de contaminación.

• Necesita de una intervención multidisciplinaria.
• Importante:  La terminación de productos de naturaleza proteica son cruciales y las fallas pueden tener implicaciones severas tanto para la salud de un paciente como para la supervivencia de la compañía.

• Las etapas “DownStream”  pueden ser un proceso ángel y efectivo, o uno mucho más complejo. No se desvincula de las operaciones “UpStream”.
• En procesos “DownStream”  los costos operacionales son más altos.

• La razón:  el requisito de calidad y efectividad del producto (especialmente si es en fines terapéuticos). Para  garantizar un producto apto y efectivo. La complejidad de los procesos son específicamente los de purificación.
• El proceso “DownStream” es uno mas lento si se compara con los “UpStream”.

• “Bottleneck Effect” – Proceso que retrasa la producción de una sustancia comercial. Se refiere a la lentitud con la que sale el contenido de una botella.

• Con los años se ha logrado maximizar la producción, en especial en el proceso “UpStream”.

• Ahora se puede lograr un volumen elevado de células y de producción en los biorreactores.

• Aún no se ha logrado un balance entre la optimización de los procesos “UpStream” y la de los proceso “DownStream”.
• Los procesos “UpStream”  se tornan más eficientes cada vez y eso acentúa un efecto del cuello de botella en los “DownStream”.
• Mucho material en las etapas iniciales (“UpStream”), pero por lo exigente de las etapas finales (“DownStream”)  ese volumen alto tarda en ser procesado.
• “DownStream”  es un proceso un poco difícil, y demás tiempo comparado con el “UpStream”.

Modulo #2:  La recuperación de productos y las etapas “DownStream” iniciales.

• De todo lo que hay dentro del tanque, aproximadamente menos del 3% es lo que realmente se desea.
• Requiere la recuperación y eliminación de muchas impurezas que son generadas en la etapa del cultivo celular o de fermentación.
• El proceso de recuperación involucra: que es lo que necesita y en donde se generó el producto que se desea.
• Es importante considerar :

• ¿Se necesita la celula entera?
• El material deseado, ¿se puede extraer sin ninguna preocupación de que se degrade o se contamine aun más?
• ¿El producto que se requiere, está adentro de la célula productora, está en la matriz extracelular o fue secretado directamente al medio de crecimiento en el tanque?

• Los procesos de recuperación tienen entre sus objetivos principales:

• Fomentar la solubilización de sustancias de interés a partir de material celular.
• Así como la de otros particulados presentes en el medio de crecimiento.
•  Es decir, separar lo que se desea, de aquello que no, pero que inicialmente es más fácil de localizar y por ende de eliminar.

• La eliminación de desechos o materiales insolubles, va de la mano con un proceso de clarificación del medio.
• Clarificación – estriba en la eliminación de células, componentes celulares y otras partículas no solubles más grandes, que pudieran dificultar el proceso “DownStream” que debe seguir.

• Sería muy problemática la purificación.
• Muchos contratiempos en las etapas de purificación posteriores.

• Dos de las tecnologías mas utilizadas para la clarificación son:

• La centrifugación
• La filtración

• Es muy conveniente eliminar el exceso de agua del medio, eso ayuda a reducir el volumen de trabajo y a concentrar las partículas presentes.
• La recuperación va a depender de:

• Si el producto deseado, es la célula entera.
• El tipo de ser una productora (Procariota vs. Eucariota)
• La naturaleza de la sustancia que se interesa.
• Si el producto esta dentro de la célula productora (y en donde esta dentro de esta).
• Si el producto fue secretado fuera de la celula.

• El proceso de recuperación es delicado si se trata específicamente de productos de naturaleza proteica.
• El proceso de recuperación de metabolitos intracelulares no son los mismos que para recuperar aquellos que fueron secretados fuera de la célula.
• Intracelular requiere más esfuerzos y tecnologías que uno que es extracelular.

• Tiene como propósito que la célula productora sea desestabilizada y su membrana debe ser perforada.

•  En células procariotas son más difíciles de recuperar, ya que en su mayoría son intracelulares (cuerpo de inclusión).
• Procariotas y levaduras es necesario la destrucción de la célula como tal.
• Eucariotas,  secretan los metabolitos al medio, o a su matriz extracelular, facilitar el proceso de recuperación.
• Procesos de Recuperación de Metabolitos Intracelulares

• Homogeneizado de células en etapa inicial de recuperación.

• Es un líquido que contiene la suspensión de las células que salieron del biorreactor.

• Se logra: Al romper o desestabilizar la membrana externa y/o pared celular.
• Es común que en este homogenizado de células estén presente mitocondrias así como otros organelos intactos.
• El  homogenizado se logra con el uso de “buffers” y técnicas especiales.

• “Buffers” ayudan a proteger el interior de las células.
• Una vez las células contiene el “Buffer” se utilizan algunas tecnologías para facilitar la extracción de la molécula interesada.
• Se debe ser muy delicado para evitar daños al producto.
•  La fase de recuperación con lleva la meta de solubilización del producto es decir la destrucción de la célula y/o la colección de los sobrenadantes (ahí es donde esta el producto).
•  Si el metabolito está secretado en el medio de cultivo no hay porque destruir las células.
• Métodos para realizar homogenización:

• Centrifugación
• Filtración

• Procesos Mecánicos

• Incluyen tecnologías o equipos que ayudan a romper la célula por la aplicación de: fuerza, fricción, cambios en presión, entre otros.
• Este proceso va a dejar más desechos de los que había en el momento de la fermentación hola cosecha de las células en los biorreactores.
• Se debe realizar de forma cuidadosa porque pueden existir riesgos de daños para la sustancias de interés (especialmente si son proteínas).
• Por esto toda metodología debe ser validada.
• Posibles efectos negativos:

• Degradación
• Desnaturalización
• Las mezclas no deseadas
• La inactivación de las sustancias de interés.

• Procesos No Mecánicos

• Libera la sustancia si la destrucción abrupta.
• Logran la permeabilización de la célula, especialmente de su membrana celular.

• Tecnologías de ruptura celular por vías mecánicas

• Homogenizadores, desestabilizadores ultrasónicos y la agitación en presencia de materiales abrasivos.

• El uso de Homogenizadores

• Para la destrucción de células.
• Solución con las células a una presión muy elevada a través de unos foros que tienen unos diámetros angostos.
• Cambios en presión súbditos, que promueve la destrucción de las células.
• Los Homogenizadores industriales tiene líneas de enfriamiento para minimizar el riesgo de desnaturalización de las proteínas.

• Desestabilizadores ultrasónicos

• Ruptura de células.
• Aplican ultrasonido para lograr destruir las células.
• Requiere alta frecuencia que viaja a través de un filamento metálico hasta la suspensión de las células y las rompe.
• A nivel de laboratorio.
• No a niveles industriales porque tiene altos costos y por la dificultad de la incorporarlo a una alta escala de producción.

• Técnicas de agitación en presencia de material abrasivo

• Exponer las  suspensión de las células, en una cámara que contiene unas esferas de material abrasivo y luego exponerlas a un proceso de agitación vigorosa.
•  Las células tendrán colisiones con las esferas y eventualmente serán destruidas.

• Retos que trae el uso de métodos mecánicos para la recuperación de productos:

• Aumento de desechos celulares y necesidad de reprocesamiento.
• Mezcla de constituyentes celulares (especialmente con ácidos nucleicos).
• Necesidad de procesos de clarificación.
• El rendimiento final de la sustancia de interés se puede ver afectado.
• Riesgos de desnaturalización y daños al producto deseado.
• Aumento en los costos operacionales.

• Por estas razones cada industria se encarga de incorporar las tecnologías que más le convenga.  La que menos afecten la calidad y la efectividad del producto.
• Métodos de desestabilización celular por vías no mecánicas

• Si necesidad de ruptura de las células.
• Facilitan, en la formación de los poros en la membrana celular, facilitar la salida de estructuras internas de interés.
• Los métodos pueden ser mayormente de naturaleza química, física o enzimática.
• Evitan exponer las células a la agitación y colisiones típicas de procesos mecánicos.
• Mayormente para trabajar con metabolitos muy delicados.

• Agentes Químicos

• Los mas que se utilizan:

• Detergentes,  antibióticos, solventes, y agentes coatrópicos (sustancias que desorganizan la estructura tridimensional en las macromoléculas y que las desnaturalizan).

• Es efectivo pero limitado a la vez.
• La sustancias químicas pueden tener efectos dañinos en la sustancias de interés.
• Pueden desnaturalizar las proteínas, inactivarlas o precipitarlas.
• Tienden a crear dificultades en las etapas de purificación.

• Algunas sustancias químicas pueden quedarse en trazas en el producto final y pueden ser incorporadas por los pacientes, un aspecto no ha aceptado por la regulación.

• Agentes químicos para lograr permeabilizar las células productoras son:

• Detergentes, DMSO (alcohol feniletilico), Tolueno, Éteres, Cloroformo, Benceno, Antibióticos, EDTA, Agentes Coatrópicos (urea, guanidina, fenol, butanol, etc.)

• Desestabilización por métodos físicos

• Desestabilizada por cambios en la presión osmótica.
• Afecta el balance osmótico.
• Ajustan las condiciones osmóticas de la célula, pero de forma controlada, para que no haya una lisis abrupta de la célula.
• Si se cambia la osmolaridad externa a la célula, está sufrirá daños en su estructura.
• Choque osmótico, se deja que la solución que contiene las células llegue a un equilibrio osmótico, al exponerlas a medio alto en sacarosa, y luego súbitamente, se renueve a ese medio el azúcar.
• Resultado: la membrana celular es dañada y sus proteínas pueden ser liberadas.
• Otra forma puede ser por congelación y descongelación.

• Uso de Enzimas

• Permeabilización enzimática, utilizada en escala de laboratorio.
• Usan principalmente lisozimas.
• Para la liberación de enzimas periplásmicas (fluido que compone el espacio que queda entre la pared celular y la membrana externa[gram negativas]) o superficiales.
• Gram positiva – Pared mas gruesa peptidoglucano.
• Gram negativa – Tiene una composición de lípidos mayor.
• Enzimas presentan un riesgo para proteínas, por eso tienen que ser utilizadas bajo condiciones altamente controladas.
• Otras enzimas que pueden ser utilizas son: Proteasas, glicanasas y manasas.

• Los procesos de mayor uso en la recuperación son: centrifugación y filtración.

• Una vez el producto ha sido liberado, es importante añadir sustancias estabilizadoras(buffer para minimizar riesgos de degradación o daño).

Modulo #3:  La Purificación de Productos.

• Los procesos “DownStream” giran entorno a la purificación.
• Los procesos “UpStream” generan muchos desechos:  se derivan del medio de cultivo y de los procesos metabólicos relacionados a las células.
•  Si el producto de interés es una proteína los procesos de purificación tienen que ser extremadamente eficientes (evitar daños), para a su vez obtener un elevado grado de pureza.
• Si la etapa “DownStream” se divide en sub-etapas, la purificación seria como un conjunto de etapas: inicial, intermedia y final.
•  El objetivo fundamental es generar un producto puro, activo, de una identidad confirmada y en un alto rendimiento.

• Pureza - El producto o sustancia de interés está libre de otras sustancias o moléculas que no son deseadas.
• Identidad - Que al final de la purificación la proteína o la molécula de interés que es obtenida conserve sus características y su naturaleza esperada.
• Rendimiento - Cuanta cantidad hay presente del producto o sustancia de interés, luego de cada etapa de procesamiento.
• Actividad - Se relaciona con la capacidad que tiene una molécula de actuar de una forma específica. Es decir que lleve a cabo el efecto deseado o esperado.
• Estabilidad - Cuando susceptible puede ser una molécula a diferentes condiciones. Mientras más estable menos su vulnerabilidad a factores externos.

• No existe ningún protocolo estándar para aplicarse de forma consistente en operaciones de “DownStream”
• Variaciones entre Industrias:

• No siempre los procesos de purificación son fáciles de replicar.
• Facilidad de subir de escala (“Scale Up”).
• No todas las proteínas son iguales, no toda técnica aplica igual.
• El objetivo no es el mismo.
• El origen de la proteína puede ser variado.
• Morfología y tamaño.
• Hacen variados procesos de purificación:

• Propiedades físico-químicas
• El punto isoeléctrico no es el mismo.
• Polaridad distinta
• Solubilidad diferente
• Nivel de estabilidad variado

• Mientras más procesos “DownStream” más aumenta la pureza del metabolito, pero el rendimiento tiende a disminuir.
• Las industrias establecen de forma clara y específica los protocolos de purificación.
• Previo al establecimiento de los procesos es necesario conocer de antemano:

• Todas las características y propiedades del producto.
• Como se pudiera afectar adversamente con el procesamiento.
• Cuáles son los contaminantes que pueden estar asociado al mismo, así como fuente de origen.

• Cada industria somete al producto sólo a aquellos procesos que son suficientes y necesarios para lograr la pureza deseada.
• Para uso en humanos los criterios de pureza serán siempre más rigurosos.
• Esquema de purificación:

• Recuperar el producto.
• Concentración y clarificación:

• Técnica de separación de baja resolución.
• Técnica de separación de alta resolución.

• Pulido Final
• Etapas de terminado (no se considera parte del proceso de purificación porque ya en éstas, el producto aunque no finalizado, se ha purificado en su totalidad).

• Estrategia de purificación tiene que ser diseñada validada y aprobada, de forma consistente, debe ser un proceso rutinario.
• La Purificación Inicial:

• Eliminar la mayoría de los desechos celulares generados.
• El objetivo a inicial es eliminar los organismos vivos de la mezcla, sustancias peligrosas y otros contaminantes presentes.
• Caldos viscosos,  inciden sobre la efectividad de los métodos de purificación.
• Remover en los procesos de purificación:

• Estructuras celulares
• Ácidos nucleicos
• Proteínas no deseadas
• Agregados proteicos
• Productos de naturaleza lípida.
• Virus
• Endotoxinas
• Desechos de sustancias utilizadas en la operación “UpStream”.

• La meta principal de la purificación es: obtener una pureza máxima con una mínima pérdida del producto de interés o de su actividad y con el menor costo posible.

• Recuperación de productos.
• Esta tarea inicial es muy necesaria porque todo esta en una menor proporción.
• Las etapas iniciales de purificación, necesitan ser más efectivas en el procesamiento de mayores volúmenes de forma simultánea.

1. Las etapas iniciales de purificación se consideran de baja resolución.
2. Trabajar con más volumen es al mismo tiempo y que se pueden realizar más rápido, pero tienen una baja selectividad.
3. La resolución de una tecnología es la habilidad de la misma para distinguir entre lo que es el producto de interés y los contaminantes asociados a este.

• Son efectivas eliminando impurezas  que son marcadamente distintas al producto de interés pero no a aquellas que son muy similares.
•  Alta resolución - Son más sensitivas permiten discriminar mejor entre el producto de interés y moléculas parecidas (son mas lentas y no permiten grandes volumenes).
• Las unidades operacionales típicas en esta etapa pueden incluir:

• Filtración
• Centrifugación
• Sedimentación
• Uso de solventes
• Precipitación
• Cromatografía

• Lo que se obtiene de un proceso, se continúa purificando en el siguiente.

• Concentración del Material Purificado:

• El volumen del caldo con producto que sale del biorreactor es muy amplio, por eso, es importante reducirlo.
• El objetivo es, obtener un material crudo de proteínas y reducir el volumen de trabajo de una manera considerable, para entonces los procesos de purificación que siguen, sean más efectivos y convenientes.

• Se remueve el exceso de agua y las sales presentes en el caldo.

• Agiliza purificación final.
• Técnicas mas comunes: Ultrafiltración, diafiltración, evaporación, precipitación y cromatografías.
• Ultrafiltración -  tamaño minúsculo de las moléculas que pueden ser filtradas y que no pueden ser eliminadas por el proceso de microfiltración.
• Diafiltración – Sistema de ultrafiltración, que mantiene un nivel constante de solventes y se recircula la solución que quieres ser concentrada.

• Precipitación

• Método utilizado en la purificación inicial.
• Procesos de ultrafiltración son preferidos.
• Precipitación -  Proceso en el que la proteína o metabolito de interés es separada del líquido, se le añade un reactivo a la solución, que hace que las proteínas no se pueda mantener en la misma.
• Recuperado por filtración o centrifugación.
• Eliminar el agente añadido que promovió la precipitación.
• Objetivos:

• Obtener la proteína  en una forma molecular intacta o en una forma en que se haga fácil llevarla a ese estado.

• Los procedimientos para la precipitación de proteínas son: “Salting Out” y Precipitación Isoeléctrica.

• “Salting Out”

• Adición de sales precipitan las proteínas.
• Sales utilizadas son: sales de amonio, sulfato de amonio y sulfato de sodio.
• Compiten con la proteína, por las moléculas de agua.
• La solubilidad depende de la cantidad de sales y del pH de la solución.
• A mayor concentración de sal, menor la oportunidad de la proteína para unirse a las moléculas de agua.
• Requiere temperaturas frías (4 oC) para que no afecten las proteínas.
• Las sales de amonio dan mayo estabilidad, y reducen el riesgo de proteólisis y de contaminación bacteriana.
• Son de bajo costo.

• Precipitación Isoeléctrica

• Ajustar el pH hasta que la proteína llegue al Punto Isoeléctrico (Sin cargas netas).
• Proteínas menos solubles.
• Solvente polar débil como: etanol o alcohol isopropílico para disminuir la solubilidad.
• Proteína llega al punto isoeléctrico se le hace muy difícil continuar en solución y se precipita.

• Precipitación con el uso de solventes especiales

• Solventes orgánicos para aumentar el contenido del material orgánico de la solución de proteínas (las que sean de interés se precipitan).
•  El solvente no debe reaccionar con las proteínas (promueve la formación de agregados), en exceso puedes desnaturalizar las proteínas.
• Efectivo en temperaturas frías.

• Clarificación del medio

• Proceso por el que se remueven los sonidos no deseados del medio.
• Los solidos no deseados pueden afectar a la purificación.
• ¿Qué recordar?

• Separación de células y otros componentes que no sean de interés, del sobrenadante, que por lo general contiene las moléculas de interés.
• Requiere el uso de variadas tecnologías.
• Es uno de los procesos que más atención recibe de parte de los departamentos relacionados a la agilización y optimización de las etapas “DownStream”.
• Alta cantidad de biomasa y desechos celulares.

• Sedimentación

• Útil en la clarificación.
• Utiliza las diferencias en densidad entre: células, partículas y el medio.
• Este proceso en términos normales es uno más lento.

• Remoción de Ácidos Nucleicos

• Con fines terapéuticos tiene que estar libre de ácidos nucleicos o sus fragmentos.
• El método más utilizado:  precipitación y el tratamiento con nucleasas.
• Sustancias catiónicas son efectivas para la precipitación tanto de DNA como RNA.
• Sustancia común para la precipitación es: polietilenemina (carcinogeno).
• Una vez  precipitado, es más fácil la remoción del material precipitado junto con los demás desechos celulares, por centrifugación y filtración.
• El uso de nucleasas también es efectivo:

• De mayor frecuencia hoy día.
• Razones: Efectividad, poco costoso y no compromete el producto final.

• Purificación intermedia y final

• Pureza que fluctúa entre los 70% y 80%.
• Propósito terapéutico requiera una pureza mucho mayor de 99.99%.
• Se basan en tecnologías de alta resolución.
• Tecnologías de alta resolución tienen alta selectividad.

• Tienen mayores costos y presenta menos capacidad para el material deseado.

• Purificación Intermedia – Remover el resto de las impurezas y posibles contaminantes.

• Remover efectivamente endotoxinas partículas virales.
• Resto de ácidos nucleicos
• Proteínas de la célula productora, que no fueron removidas por el proceso inicial de purificación.
• Efectividad de eliminar la gran mayoría de los contaminantes.
• Cromatografías son muy comunes en esta etapa.
• Éstos procesos requieren el cambio constante de solventes (por el proceso de diafiltración).
• Se pueden utilizar métodos como electroforesis. A escalas industriales no es costo efectivo.

• Purificación final – Es eliminar todas las trazas de materiales que no deben estar en el producto final.

• Típicamente la pureza o el pulido final se logran con algunas técnicas de cromatografía.
• Concentrar el material que contiene el producto de interés y entonces sigue el pulido final.
• Purificación final son más rápidos y fáciles porque el material está bastante limpio gracias a las etapas anteriores.
• Las industrias utilizan métodos que además de obtener alta pureza puedan tener también alto rendimiento.
• Con frecuencia la finalización en la etapa de purificación final incluye entonces la cristalización de los productos de interés, especialmente de aquellos que son delicados por ejemplo, al calor.

Modulo #4: Metodologías de separación utilizadas en procesos “DownStream” Parte 1.

• Filtración tiene una mayor versatilidad y aplicabilidad.
• Centrifugacion:

• Separar solidos de líquidos de diferente densidades.
• Esta técnica se utiliza desde la recuperación de metabolitos hasta la clarificación de los medios.
• Uso mas amplio escalas de laboratorio escalas de producción de menor nivel.
• En escalas de producción, es mucho mas efectivo utilizar procesos de filtración y de cromatografía.
• La centrifugación funciona por movimiento rotatorio con una mayor fuerza grevedad.
• Permite la separación de una fase acuosa a una fase sólida (pellet).
• Contiene rotores, donde se colocan los tubos.
• Datos operacionales:

• Tiene que estar adiestrado según la industria.
• Las centrífugas varían según el fabricante.
• Verifiqué la calibración antes de su uso y balancearla.

• Certificación de que el equipo cumple (certificación con fechas de vigencia).
• Utilizar equipos que no estén calibrados pueden dañar el proceso.
• Dependiendo del error puede ser despedido.

• Muy frecuentemente el sobrenadante de la mezcla contiene las proteínas.
• El “pellet”  con los componentes celulares más grandes.
• El proceso de centrifugación puede ser preparativo o analítico.

• Preparativo -  Para la separación de materiales que serán utilizados en otro momento.
• Analítico -  determinar el peso  molecular y otras características físicas de proteínas u otras macromoléculas.

• Baja Velocidad – Menos de 10,000 RPM,  para cosechar células animales o vegetales, separar componentes sanguíneos y para conectar hoy canelos más grandes (nucleo).
• Alta Velocidad – Hasta 30,000 RPM,  para purificar virus, aislar mitocondrias, lisozimas y otros organismos de tamaño medio.
• Ultracentrífugas – Hasta 120,000 RPM,  purificación de organelos pequeños, como ribosomas. Además para purificar DNA, y RNA y proteínas.
• Microcentrifugas:

• Con volúmenes desde 1μL hasta 2mL.
• Para purificar ácidos nucleicos y para separar soluciones de volúmenes pequeños.
• Escala de laboratorio.

• Datos Operacionales:

• No se pueden balancear las centrífugas al ojo por ciento, se tiene que seguir el procedimiento.
• Se requiere conocer el peso exacto de las muestras a centrifugar.
• Buscar tubos vacíos, se pesan y se llenan con agua, hasta igualar los pesos.
• Las balanzas debe de estar bien calibradas.
• Se colocan de forma equitativa.
• Verificar que cierre bien.
• Seguir los SOP y parámetros específicos:  temperatura, tiempo, velocidad, etc.
• Ajustar temperatura (la rotación del equipo aumenta la temperatura, puede dañar el producto).

• Como  convertir de RPM a RCS (fuerza g)

• Las RPM son dependientes del radio rotacional de cada centrífuga, es decir, la longitud del brazo unido al rotor.
• RCF – “Rotational Centrifugal Force”
• RCF o la g,  es una unidad mucho más precisa si se quiere duplicar un procedimiento.
• Como convertir:
• g= (11.8)(r) x (n/1000)2
• r=  Radio del rotor de la centrífuga en centímetros.
• n=  velocidad en RPM

• Centrifugacion diferencial

• Se separa la muestra en dos fases: una sólida del material sedimentado (pellet) y una líquida (sobrenadante).
• Centrifugación por gradiente – Es una columna de fluidos que aumenta la densidad desde el tope de la centrífuga hasta el fondo de la misma.  Pueden ser formados en capas o pasos.
• Gradientes continuos -  Donde existe una ligera disminución densidad desde el tope hasta el fondo y en donde no hay extremos marcados entre capas.
•  Centrifugación continua -  Utilizaba en operaciones industriales a gran escala.

• Centrifugas en los procesos “DownStream”:

• Tubulares: útiles para remover agua. Además son fáciles de enfriar (beneficiosos para el trabajo con proteínas).
• Centrifuga de discos (“Disk stack”)
• Tipo canasta
• Decantador
• Decantador con discos (“Disk decanter”)

• Ventajas de esta tecnologia:

• Sistema completamente continuo.
• Procesamiento de grandes volúmenes.
• No requiere membranas, químicos o aditivos costosos.
• Fácil de establecer como proceso conjunto con la filtración en las etapas de recuperación y purificación inicial.
• Metodología permite análisis.

• Algunas desventajas:

• Altos costos iniciales
• Ruidosas
• Alto costo de electricidad
• Destrucción de células  y/o moléculas de interés.

•  Procesos de filtración en las operaciones “DownStream”

• Proceso sencillo  en el que se remueven materiales de una mezcla, gracias al uso de un material que tiene la capacidad de retener unos componentes de la mezcla mientras dejan atravesar otros de menor tamaño.
•  Se puede utilizar desde las etapas iniciales hasta en la de terminación.

• ¿Qué es la filtración?

• Separación, que utiliza un material con orificios y llamado el elemento filtrante, para remover partículas que se encuentra en una mezcla líquida o gaseosas.
• Modo de acción:

• La no deseada se queda atrapada en el filtro.
• La de interés pasa a través del filtro.
• Hay técnicas que funciona alreves.

• La filtración es utilizada en la esterilización de productos de naturaleza proteica.

• Con otras técnicas de esterilización simplemente se desnaturalizan.

• Aplicación en la industria (Biomanufactura “DownStream”)

• Este proceso es útil en:

• Recuperación de células.
• Clarificación
• Purificación intermedia
• Purificación final
• Formulación
• Llenado

• En especifico los filtros de esterilidad.

• Además, utilizados en etapas de remoción viral y de tratamiento de agua.

• En etapas “DownStream” se puede filtrar aire y liquido
• Algunos usos principales del uso de filtración en etapas “DownStream” son:

• Filtración de “Buffers”, aditivos para medios de cultivo.
• Remoción de microorganismos, virus y otras partículas contaminantes.
• Preparación de agua de calidad para productos terapéuticos.
• Antes y después de procesos de cromatografía.
• Productos formulados “bulk” final.
• Producto finalizado (llenado estéril).
• Filtración de aire de tuberías para tanques.

• Estructura de un filtro

• Filtrante o el cartucho tiene la función de retener cierto tipo de material y dejar pasar otros.

• Protegidos por el contenedor del filtro o el “housing”,  construido de acero inoxidable.
• “Housing” es proteger el cartucho de contaminación y de otros elementos externos.
• Puede tener adaptado en varias válvulas.
• Las válvulas tienen varias funciones, entre las que sobresalen:

• Modificar la presión
•  La facilidad de tomar muestras del material que se filtra.

• Cerradura del “Housing” tiene que estar bien sellada y las zonas de las válvulas deben estar libres de orificios.
• Parte sucia del filtro zona donde va a llegar primero el material que va a pasar a ser filtrado.
• Por donde sale, sale por la zona de salida del filtro o la parte limpia.

•  Concepto de eficacia de un filtro

• Por ciento de partículas de un tamaño dado que un filtro remueve de una solución o material filtrado.
• Uno de los factores más considerados para la utilización de los filtros.
• Depende, de contaminantes que se encuentren en el material filtrado así como el tipo de fluido que es filtrado.

• Modo de operación de un filtro

• Flujo normal (NFF): filtración de flujo directo o como filtración sin salida es el más cómodo.
• Flujo  tangencial (TFF), la filtración de flujo cruzado.

• Filtración de Flujo Normal (NFF)

• La solución o material que va a ser filtrado atraviesa una membrana o elemento filtrante que estar organizado de forma perpendicular al flujo.
• Las partículas más grande se retiene y las que tienen un menor diámetro al de los foros del filtro, pasan con el material filtrado.
•  El paso del material a filtrarse requiere presión para ser mas efectivo  el proceso, de lo contrario pasa por gravedad hasta que el elemento filtrante se tape.
• Es muy común que mientras más viscosa, mayor la probabilidad de que el elemento filtrante se tape.
• No todos  los poros de un filtro de una membrana son del mismo tamaño.
• Filtros de membrana deben su efectividad del tamaño de los poros.
• No todas las membranas de un mismo manufacturero tienen la misma conformación.
• Tamaño de los poros y, orificio más pequeño que posee el filtro, o al promedio.
• Por lo general, en micrómetros μm.
• Los filtros se catalogan: nominal o absoluta.
• Filtros de flujo normal:

• Filtro grueso 8-100μm
• Filtros de superficie 0.5-30μm
• Filtros de membrana 0.05-10μm

• Conceptos de clasificación del elemento filtrante

• Clasificación nominal

• No todos los poros son del mismo tamaño.
• Se promedia el tamaño.

• Clasificación absoluta

• Distribución altamente ordenada de sus poros.
• Por lo general son filtros de membranas.
• No todos tienen el mismo tamaño.
• En los procesos de esterilidad 0.22μm

• Repaso

• Partícula visible más pequeña - 50μm
• Células sanguíneas – 10-30μm
• Levaduras – 5-10μm
• Mayoría de las bacterias – 0.3μm
• Virus – 0.03μm

• Los virus son más difíciles de remover porque son más pequeños.
• Para la técnica de  ultrafiltración se confeccionan las membranas o elementos filtrantes de manera mucho más precisa.
• Filtración de flujo tangencial (TFF)

• Pasa de forma paralela a la superficie de la membrana o el elemento filtrante. Una porción pasa través de la membrana, mientras que la otra porción es recirculada.
• Promueve una acción de barrido que ayuda a evitar que el material tape la membrana.
• Para filtrar soluciones que contienen un alto contenido de partículas muy pequeñas.
• Dos aplicaciones comunes:

• Microfiltración
• Ultrafiltración

• Microfiltración (MF)

• Tienen diámetro entre 0.1 y 10μm.
• Útiles en la remoción de ser unas enteras, algunas estructuras internas, partículas grandes y la gran mayoría de los microorganismos.

• Ultrafiltración (UF)

• Es efectivo en la retención de moléculas, este tipo de membranas van de uno a 20nm.
• Pueden retener proteínas pequeñas y de bajo peso molecular.
• MWCO – “Molecular Weight Cut Off”,  se refiere a la capacidad de retener moléculas.
• Utilizada para la concentración del material en las etapas iniciales de purificación.
• Utilizada en las industrias biotecnológicas porque es segura para el trabajo con proteínas.
• Utilizada para fraccionamiento, para la concentración o para la remoción de sales.
•  Funciona: forzando un solvente a través del filtro mientras que el soluto queda retenido.
• UF va de 1 a 300 kDa (mas usadas de 3, 10, 30, 50 y 100 kDa).
• Son cilindros.
• UF son:  acetato de celulosa o nitrato de celulosa, aunque hay otros materiales como el cloruro de polivinil y el policarbonato que están siendo utilizados en su confección.
• Tienen que ser confeccionados de materiales que tengan propiedades de baja absorción con las proteínas.
• Aplicación de presión para flujo adecuado a través del filtro.
• Ventajas de la UF:

• No interfiere con la bioactividad de las proteínas.
• Alto grado de recuperación (sobre el 99%) de las proteínas de interés.
• Proceso de concentración rápido.
• Muy pocos equipos auxiliares o requeridos.

•  Filtros de ventilación (“Vent Filters”)

• En el respiradero del tanque
• Evitan que entren contaminantes presentes en el aire.
• Ayuda a que los se eliminen gases y no contamine de factores externos.

•  Filtros de producto o de esterilidad (Críticos)

• Etapas de formulación final y en la de llenado.

•  Aspectos operacionales antes del uso de un filtro:

• Si el filtro es estéril se requiere de un manejo aséptico para evitar contaminación.
• Se debe verificar su fecha de expiración y todas sus partes.
• Fallas pueden contaminar el producto o afectar la compañía.

• Durante se uso:

• Verificar que el filtro no esté tapado, que no tiene liqueos o escapes.
• Verificar si hay problemas en su ensamblaje.
• Buenas prácticas acéticas y evitar abrir el contenedor del filtro.

• Después de su uso:

• Rotulación adecuada
• Escribe que filtro fue utilizado para manejar un producto X y la fecha de su uso.
• Un manejo aséptico
• A los filtros también se le realizan unas pruebas importantes luego de su uso.
• No llevar los filtros al cuarto de limpieza si aún no se han realizado los análisis.

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