CARACTERIZACION DE ACTINOBACTERIAS RARAS, DEGRADADORAS DE LIGNOCELULOSA: DEMOSTRACION DE ACTIVIDAD LACASA EN DOS AISLADOS DE Tsukamurella Sp Y Cellulosimicrobium Sp

CARACTERIZACION DE ACTINOBACTERIAS RARAS, DEGRADADORAS DE LIGNOCELULOSA: DEMOSTRACION DE ACTIVIDAD LACASA EN DOS AISLADOS DE Tsukamurella sp y Cellulosimicrobium sp

Título corto: ACTIVIDAD LACASA EN Tsukamurella sp y Cellulosimicrobium sp

CHARACTERIZATION OF LIGNOCELLULOSE-DEGRADING RARE ACTINOBACTERIA: DEMOSTRATION OF LACCASE ACTIVITY IN TWO ISOLATES OF Tsukamurella sp AND Cellulosimicrobium sp

Enrique Luis Revollo Escudero, Oriana Danuta Serna Daza, Jorge Hernández Torres*

Centro de Innovación en Biotecnología Industrial y Biología Molecular (CINBIN), Universidad Industrial de Santander, Sede de la UIS en Guatiguará, Km 2 vía al Refugio, Piedecuesta (Santander), Colombia.

(*) Autor para correspondencia: Jorge Hernández Torres, M.Sc., Ph.D., hernanj@uis.edu.co

RESUMEN

Las características fisicoquímicas de la lignina y su compactación con la celulosa han dificultado la explotación biotecnológica de enormes cantidades de biomasa vegetal. Las lacasas constituyen una subfamilia de oxidasas multicobre que intervienen en la despolimerización de la lignina. Si bien han sido ampliamente caracterizadas en los hongos, los estudios de la diversidad y las funcionalidades de las lacasas en los procariotas se han centrado especialmente en isoformas enzimáticas de Streptomyces sp. En este trabajo se aislaron 20 cepas de actinobacterias del suelo. La actividad lacasa de 17 de ellas fue evidenciada en ensayos cualitativos con guayacol y dos cepas seleccionadas fueron caracterizadas en detalle. Las pruebas morfológicas y el análisis de las secuencias del gen 16S rRNA apuntan a que estos dos aislados pertenecen a los géneros Tsukamurella y Cellulosimicrobium. En cultivo sumergido con agitación, AC01 (Tsukamurella sp.) expresó una máxima actividad de oxidación de ABTS (2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) de 108 U/L. Por otra parte, AC18 (Cellulosimicrobium sp.) que había exhibido una actividad oxidativa de guayacol superior a las 16 cepas restantes y demostró ser resistente a niveles tóxicos de cobre, logró un valor máximo de oxidación del ABTS de 0,56 U/L. Estos resultados sugieren que en el aislado AC18 operaría un fenómeno de especificidad de sustrato o de inductor, regulador de la expresión y de la actividad lacasa cuantificable. La caracterización genómica y funcional de las lacasas de nuevas actinobacterias lignocelulósicas ampliará la gama de centros redox con aplicaciones biotecnológicas específicas, además de facilitar el establecimiento de sus relaciones evolutivas con las eucariotas.

PALABRAS CLAVES: Actinobacteria, deslignificación, enzimas modificadoras de lignina, EC 1.10.3.2, ABTS

ABSTRACT

The physicochemical characteristics of lignin and its compaction with cellulose have restricted the biotechnological exploitation of enormous amounts of plant biomass. Laccases are a subfamily of multicopper oxidases involved in lignin depolymerization. Although they have been extensively characterized in fungi, studies of the diversity and functions of laccases in prokaryotes are mainly on enzyme isoforms of Streptomyces sp. In this work we isolated 20 strains of soil actinomycetes. The laccase activity of 17 of them was evidenced in qualitative assays with guaiacol, and two selected strains were characterized in detail. The morphological evidence and the analysis of the 16S rRNA gene sequences suggest that these two isolates belong to the genera Tsukamurella and Cellulosimicrobium. In submerged cultures with shaking, AC01 (Tsukamurella sp.) exhibited a maximal oxidation activity of ABTS (2,2 '-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) of 108 U/L. On the other hand, AC18 (Cellulosimicrobium sp.) that exhibited a higher oxidative activity of guaiacol than the other 16 isolated strains and showed resistance to toxic levels of copper, reached a maximum ABTS oxidation rate of 0.56 U/L. These results suggest that in AC18 operates a mechanism of substrate or inducer specificity, regulating the measurable laccase activity and laccase gene expression. Genomic and functional characterization of laccases of new ligninolytic actinomycetes may help to extend the range of redox centers with specific biotechnological applications, as well as establishing their evolutionary relationships with eukaryotes.

KEYWORDS: Actinobacteria, delignification, lignin-modifying enzymes, EC 1.10.3.2, ABTS

Recibido: enero 2 de 2012

Aprobado: noviembre 25 de 2012

INTRODUCCIÓN

Los altos contenidos en celulosa de la biomasa vegetal (>45%, peso seco) son una excelente materia prima potencial para la obtención de biocombustibles y otros compuestos orgánicos (Lynd et al., 1999). No obstante, el aprovechamiento industrial de la biomasa lignocelulósica no ha alcanzado su punto de madurez en razón a las propiedades físicas y químicas de la lignina y su densa compactación con la celulosa (Weimer, 1996; Lynd et al., 1999; Tuomela et al., 2002). En efecto, la relativa hidrofobicidad de la lignina reduce la permeabilidad de la pared celular vegetal, lo cual obstaculiza su degradación por agentes biológicos. En consecuencia, la industria ha recurrido al desarrollo de procesos químicos de deslignificación; sin embargo, los investigadores en biotecnología están impulsando el desarrollo de métodos biotecnológicos de despolimerización de la lignina (Lynd et al., 2002).

La lignina no es digerible por los animales pero sí por hongos y bacterias secretoras de enzimas que pueden degradar el polímero. Aunque se ha utilizado el término genérico “ligninasa”, es preferible referirse a “enzimas modificadoras de lignina” (lignin-modifying enzymes o LMEs) ya que no catalizan reacciones hidrolíticas sino oxidativas (Winquist et al., 2008). Las LMEs comprenden las peroxidasas y muchas fenol-oxidasas del tipo lacasas (Shah y Nerud, 2002).

Las lacasas (1,2-benzenediol:oxígeno óxidorreductasa, EC 1.10.3.2) son oxidasas de una variedad de compuestos aromáticos (p-difenoles) y se caracterizan por poseer 3 centros catalíticos: Un centro T1, mononuclear, se encarga de la oxidación del sustrato, mientras que dos centros T2 y T3, forman un centro trinuclear, el cual se encarga de reducir el oxígeno molecular a agua (Alcalde y Bulter, 2003; Arias et al., 2003). Entre los sustratos naturales de las lacasas se incluyen fenoles, polifenoles, anilinas, aril-diaminas, fenoles metoxi-sustituidos, hidroxi-indoles, benzenotioles, compuestos metálicos orgánicos e inorgánicos, entre otros (Kunamneni et al., 2008a).

Entre las aplicaciones potenciales de las lacasas se encuentran: deslignificación

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